Молекулярно-генетичні порушення, асоційовані з гострими лейкеміями у дітей

<p>РОЗДІЛ 2<br />МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ<br />2.1. Загальна характеристика хворих<br />Групу обстеження склали 110 пацієнтів у віці від одного до 18 років, у яких був<br />встановлений діагноз гострої мієлобластної лейкемії (35 дітей) та гострої<br />лімфобластної лейкемії (75 дітей). Додатково було обстежено 19 дорослих віком<br />від 19 до 32 років, хворих на ГМЛ. У одного дорослого діагностована вторинна<br />ГМЛ після лікування з приводу лімфогранулематозу. <br />Контрольну групу складали 20 здорових дітей віком від 4 до 18 років, які були<br />рідними братами та сестрами дітей, що входили в основну групу спостереження. <br />Обстежені діти та дорослі знаходилися на стаціонарному лікуванні у відділенні<br />радіаційної гематології дитячого віку (зав. відділення - д.мед.н. К.М.Бруслова)<br />та відділі гематології та трансплантології (зав. відділу - чл.-кор. АМН<br />України, проф. В.Г.Бебешко) Інституту клінічної радіології Наукового центру<br />радіаційної медицини АМН України, а також відділі гематології дитячого віку<br />Науково-дослідного інституту гематології та переливання крові АМН України (зав.<br />відділу - к.мед.н. В.Д.Дроздова). Діагноз лейкемії встановлювався<br />співробітниками зазначених медичних закладів після клінічного та<br />клініко-лабораторного обстеження. <br />Оцінка первинного клінічного статусу включала огляд шкірних покривів, розміри<br />печінки та селезінки, наявність збільшених лімфовузлів, лейкемічних проявів з<br />боку центральної нервової системи та осалгій. Геморагічний синдром визначався<br />за наявністю крововиливів на шкіряних покривах та кровотеч. Лімфоаденопатія<br />діагностувалася при збільшенні лімфовузлів в усіх групах тіла більше за 2 см,<br />збільшення розмірів печінки та селезінки визначалося пальпаторно – більш ніж 2<br />см нижче краю ребра. <br />У гемограмі до уваги брали абсолютну кількість лейкоцитів, тромбоцитів, рівень<br />гемоглобіну та відсоток бластних клітин. У кістковому мозку оцінювали відсоток<br />бластних клітин. <br />Для оцінки взаємозв’язку між клональними генетичними порушеннями та<br />ініціальними клініко-лабораторними показниками пацієнтів ранжували відносно<br />абсолютної кількості лейкоцитів (група 1- з лейкоцитами менше, або дорівнює 20<br />Г/л, та група 2- з лейкоцитами більше за 20 Г/л), тромбоцитів (група 1 – більше<br />за 150 Г/л, група 2-тромбоцитопенії з числом тромбоцитів нижчим за 150 Г/л),<br />рівня гемоглобіну (група 1 – із зниженим гемоглобином менше 100 г/л, та група 2<br />– з нормативними показниками гемоглобіну більше за 100 г/л) та наявності або<br />відсутності бластних клітин в периферичній крові та кістковому мозку. <br />Для встановлення діагнозу використовували результати морфологічного дослідження<br />елементів периферичної крові і кісткового мозку, даних цитохімічного<br />дослідження і імунофенотипових ознак бластних клітин. Варіант гострої лейкемії<br />виділяли відповідно до FAB-класифікації (М0, М1, М2, М3, М4, М4Ео, М5, М5а для<br />ГМЛ і L1, L2, L1/L2 для ГЛЛ). <br />Дослідження імунофенотипу бластних клітин проводили у відділі імунології<br />Наукового центру радіаційної медицини АМН України (зав. д.мед.н. Д.А.Базика).<br />Аналізувалися імунологічні маркери: CD34, HLA-DR, CD38, CD10, CD19, CD20, CD22,<br />CD5, CD3, CD7, CD4, CD8 і CD13, CD33. На підставі імунофенотипових ознак<br />бластних клітин проведено розподіл ГЛЛ на Т-клітинні та В-клітинні ГЛЛ і<br />відповідно В-ГЛЛ - на про-В, загальну ГЛЛ та пре-В-ГЛЛ. <br />Для оцінки особливостей клінічного перебігу захворювання аналізували відповідь<br />на терапію на 33-й день від початку лікування (наявність або відсутність<br />ремісії), тривалість ремісії (безрецидивне виживання), наявність рецидиву, час<br />настання рецидиву, а також п’ятирічне загальне виживання. Критерієм досягнення<br />повної ремісії була відносна кількість бластних клітин в показниках мієлограми<br />до 5 %. Резистентність до терапії відмічалася при недосягненні ремісії. <br />Лікування хворих проводилося за стандартними протоколами інтенсивної<br />поліхіміотерапії відповідно до імуноцитоморфологічного варіанта захворювання.<br />Троє пацієнтів відмовилися від проведення терапії в першому гострому періоді<br />захворювання і були виключені із подальшого спостереження. Шістьом пацієнтам<br />була проведена трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин периферичної<br />крові (двом пацієнтам – алогенна трансплантація і чотирьом – аутологічна<br />трансплантація). Медіана тривалості спостереження за пацієнтами складала 32<br />місяці (від 1 до 182 місяців). <br />2.2. Методи дослідження<br />В роботі використовувались цитогенетичні та молекулярно-генетичні методи<br />дослідження. <br />Цитогенетічне дослідження клітин кісткового мозку проводилося 45 пацієнтам на<br />стадії маніфестації захворювання (19 пацієнтам з ГМЛ і 26 пацієнтам з ГЛЛ).<br />Експресію химерних генів досліджували в зразках кісткового мозку та<br />периферичної крові на момент встановлення діагнозу у 93 дітей (32 дитини з ГМЛ<br />та 61 – з ГЛЛ) та у 19 дорослих, хворих на ГМЛ. Дослідження клональних<br />перебудов генів IgK і IgH проводилося у 40 пацієнтів з ГЛЛ, 12 пацієнтів з ГМЛ<br />та 20 осіб контрольної групи. Нестабільність мікросателітної ДНК досліджували у<br />28 пацієнтів (7 - з ГМЛ і 21 з ГЛЛ), а також у 10 здорових дітей (табл.2.1). <br />Для дослідження експресії химерних генів виділяли рибонуклеїнову кислоту (РНК)<br />з клітин кісткового мозку та периферичної крові. Для вивчення клональних<br />перебудов в генах IgК та IgH ДНК екстрагували з клітин кісткового мозку та<br />периферичної крові. Для вивчення мікросателітних порушень використовували ДНК,<br />яку отримували з букального епітелію та клітин кісткового мозку або<br />периферичної крові. <br />Таблиця 2.1 <br />Методи дослідження та групи дітей, які були обстежені<br />Найменування дослідження<br />Кількість обстежених пацієнтів з ГМЛ <br />Кількість обстежених пацієнтів з ГЛЛ<br />Всього<br />Цитогенетичне дослідження каріотипу</p>