РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
В дослідження було включено 173 жінки віком від 26 до 54 років, які знаходились
на лікуванні у клінічній лікарні „Феофанія”. Був заключений договір з клінічною
лікарнею „Феофанія” на підставі якого ми могли працювати з архівним матеріалом
і досліджувати біопсійний та операційний матеріал хворих який брали у
патологоанатомічному відділенні цієї лікарні. Усі встановлені діагнози були
люб’язно нам надані в патологоанатомічному відділенні лікарні „Феофанія”.
Діагноз залозиста та атипова гіперплазія був встановлений 28 (16,2%) та 31
(17,9%) жінці відповідно. Високо-, помірно- та низькодиференційована
аденокарциноми зустрічались у 21 (12,1%), 41 (23,7%) та 29 (16,8%) випадках
відповідно. Контроль склали 23 (13,3%) жінки у яких при діагностичних
маніпуляціях не було виявлено патологічних станів.
Матеріалом дослідження були парафінові блоки незміненого ендометрію переважно
фази проліферації та хворих жінок з попередньо встановленим діагнозом у
лікарні. Досліджений матеріал було розподілено на наступні групи:
1 – контроль – препарати ендометрію, у яких не було виявлено гіперплазію
ендометрію;
2 – препарати ендометрію жінок, хворих на залозисту гіперплазію;
3 – препарати ендометрію жінок, хворих на атипову гіперплазію;
4 – препарати ендометрію жінок, хворих на високодиференційовану аденокарциному;
5 – препарати ендометрію жінок, хворих на помірнодиференційовану
аденокарциному;
6 – препарати ендометрію жінок, хворих на низькодиференційовану аденокарциному.
2.2. Методи дослідження
Робили серійні зрізи з кожного блоку певної хворої. Для підтвердження діагнозу
проводили забарвлення зрізів гематоксиліном-еозином [23]. При забарвленні
гематоксиліном-еозином серед клітин сполучної тканини переважну кількість
складали фібробласти, в незначній кількості зустрічались макрофаги та інші
клітинні елементи. При лектиногістохімічному забарвленні вказані клітини
сполучної тканини не диференціюються. Тому в подальшому ми вживали термін
клітини сполучної тканини, маючи на увазі, що вони представлені в основному
фібробластами.
На наступних зрізах проводили виявлення колагенових волокон використовуючи
методику Novelli [171], визначення вмісту рецепторів до лектинів за допомогою
лектиногістохімічного методу та естрогенів та прогестерону за допомогою
імуногістохімічного методу. Проводили якісний та кількісний аналіз отриманих
результатів.
2.2.1. Визначення вмісту рецепторів до лектинів за
допомогою лектиногістохімічного методу
Лектиногістохімічний метод дослідження дає можливість ідентифікувати та
визначати локалізацію вуглеводних детермінант. Це пояснюється здатністю різних
лектинів проявляти максимальну спорідненість до специфічних вуглеводних
детермінант (глюкокон’югатів) суто визначеної структури [53].
Препарати обробляли за допомогою лектинів вітчизняного виробництва (НВК
„Лектинотест”, Україна). Використовували лектини омели білої (ML-1), арахісу
(PNA), гороху (PSA), бузини чорної (SNA), зародків пшениці (WGA) та клубнів
картоплі (STA) (табл.2.1).
Таблиця 2.1
Специфічність лектинів до вуглеводів
Лектин
Вуглевод
PSA (гороху)
б-D-маноза
PNA (арахісу)
в-D-галактоза
ML-1 (омели білої)
N-ацетил-D-глюкозамін
SNA (бузини чорної)
N-ацетилнейрамінова (сіалова) кислота
WGA (зародків пшениці)
N-ацетил-D-глюказамін та
N-ацетилнейрамінова кислота
STA (клубнів картоплі)
N-ацетил-D-глюказамін
Лектини розводили у відношенні 1:50 за рекомендованою методикою, що була
запропонована в роботі Луцика А.Д з співавторами [53]. Візуалізацію проводили
за допомогою диамінобензидин-перекис водню. У кожному випадку аналізували 1000
клітин. Інтенсивність забарвлення оцінювали в балах:
0 – відсутність забарвлення, 1 – слабке забарвлення, 2 – помірне забарвлення, 3
– сильне забарвлення та 4 – дуже сильне забарвлення.
Оцінювали інтенсивність забарвлення у цитоплазмі, на апікальній, базальній, у
поверхневому комплексі епітелію залоз; на колагенових волокнах, в цитоплазмі та
у поверхневому комплексі клітин сполучної тканини, у клітинах ендотелію
мікрогемосудин ендометрію.
2.2.2. Визначення вмісту рецепторів до естрогенів та прогестерону
імуногістохімічним методом
При проведенні фундаментальних досліджень, пов’язаних із вивченням механізмів
канцерогенезу, у якості маркерів для уточнення гістогенезу окремих форм і
цитологічних варіантів пухлин різного походження в останній час поряд з
традиційними морфологічними методами все ширшого застосування знаходять не лише
лектиногістохімічний метод, а й імуногістохімічний метод з використанням
широкого спектру моноклональних антитіл. Введення в практику імуногістохіміного
методу визначення рецепторів естрогенів та прогестерону у тканинних зрізах
відкрило нові можливості більш точного визначення чутливості пухлини до
гормонотерапії [12, 16, 43, 84, 110, 143, 144, 148, 156, 165, 185].
Консультативну та методичну допомогу з імуногістохімії до рецепторів естрогенів
та прогестерону було надано на базі лабораторії патоморфології інституту ПАГ
АМН України.
Імуногістохімічне дослідження проведено у 61 хворих.
Протокол забарвлення: депарафінізація зрізів товщиною 4-5 мкм на скло, з
попереднім демаскуванням антигену у цитратному буфері рН 6,0 в мікрохвильовій
печі протягом 10 хв при потужності 600 Вт. Промивка в дистильованій воді,
блокування ендогенної пероксидази 3% розчином пероксиду водню, промивка в воді,
промивка в PBS-буфері рН 7,5, блокування неспецифічних протеїнових сполук 2
краплями Protein Block (Serum-Free: 0,25% casein in PBS) Ready-to-Use.
Інкубація з первинним
- Киев+380960830922