РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Робота виконана впродовж 2000-2006 рр. у лабораторіях біотехнології бактеріальних препаратів та молекулярної біології Інституту ветеринарної медицини УААН. Дослідження протективної активності експериментальної вакцини проти бешихи свиней, виготовленої на основі антигену бактерій бешихи штаму М-2 ВК, проводили в умовах господарства АПК "Криворіжсталь" (теперішня назва - АПК ВАТ "Арселор Міттал Кривий Ріг").
В дослідах із вивчення молекулярно-біологічних та антигенних властивостей бактерій використовували TEMED, 2-МЕ, ЕДТА - Merck; акріламід (2Х), бісакріламід, персульфат амонію - Serva(r); Coomassie R250 та Coomassie G250, Тween-20, Тріс-HCl, oртофенілендіамін, антитіла проти імуноглобулінів свині, мічені пероксидазою хрону - Sigma(r); гліцерин - Fluka(r); агарозу NA, бромистий етидій, маркери молекулярної маси білків - Pharmacia(r); ДНК маркер "1 kb DNA ladder" - Stratagene; ДНК маркер "100 b(+) DNA ladder" - Fermentas(r); БСА (fr.V) - Boehringer Mannheim; Montanide ISA-25 (Seppіc(r)); повний та неповний ад'юванти Фрейнда - Difco(r); знежирене молоко; мікробіологічні барвники - генціанвіолет, фуксин, розчин Люголя, метиленовий синій.
При вивченні нешкідливості, імуногенності та протективних властивостей вакцин використовували лабораторних білих мишей масою 17±1 г - 1170 голів, мурчаків середньою масою 250±50 г - 20 голів та сільськогосподарських тварин - свиней віком 3,5-4 місяці - 124 голови.
У господарстві АПК "Криворіжсталь" на період проведення дослідів і до цього часу утримувалось близько 20 тисяч голів свиней різних вікових груп та близько 800 голів великої рогатої худоби.
Всі тварини були розміщені на двох виробничих площах: племінна ферма з поголів'ям близько 8 тисяч голів та промислова зона - біля 12 тисяч голів свиней. В господарстві вирощують дві породи - велика біла та ландрас. Племінних тварин, в основному, використовують на ремонт основного стада.
Всі гострі досліди з контрольним зараженням підтитрованим патогенним штамом збудника бешихи проводились в окремому приміщенні, обладнаному для утримання свиней з метою виключення розповсюдження збудника бешихи на основне поголів'я.
Для пошуку штаму - кандидата для виготовлення інактивованої емульсин-вакцини для профілактики бешихи свиней використовували виробничі та контрольні штами Erysipelothrix rhusiopathiae, з колекції штамів мікроорганізмів Інституту ветеринарної медицини УААН, та польові ізоляти, перелік яких наведено у таблиці 2.1.
Для культивування штамів E. rhusiopathiae застосовували МПБХ та МПАХ наступного складу, %: пептону - 0,5; натрію хлориду - 0,2; калію фосфорнокислого однозаміщеного - 0,3; натрію фосфорнокислого двозаміщеного - 2; детергенту Tween-80 - 0,05; сироватки крові великої рогатої худоби, коней або овець інактивованої стерильної без консервантів - 8 - 10; глюкози - 0,4; амінного азоту - 180-220 мг %. Для отримання твердого середовища (МПАХ) до МПБХ додавали 2,0% агар-агару мікробіологічного виробництва Іспанії. Сироватку крові коней або ВРХ інактивовану стерильну без консервантів в кількості 8-10% та глюкозу в вигляді 40% розчину в кількості 0,4 % в перерахунку на суху речовину додавали після стерилізації перед розливанням в чашки Петрі. Поживне середовище мало рН в межах 7,6 ± 0,2. Інші дослідження проводили на стандартних середовищах МПА, МПБ, МППБ, середовищі Сабуро.
З метою пошуку оптимального середовища для культивування вакцинних штамів бактерій бешихи в порівняльному аспекті використовували середовище Фейста (СФ). Виготовлене за прописом автора [136] та модифіковане нами середовище Фейста (СФМ) мало наступний склад: 6 г глюкози, 15 г пептону (Becton Dickinson, USA), 5 г дріжджового екстракту (Difco), 0,5 г аргініну (Sigma), 0,5 cм3 олеїнової кислоти (Merck), 0,2 г сульфату заліза
Таблиця 2.1 - Штами бактерій Erysipelothrix rhusiopathiae, які
використовувались в дослідженнях
ШтамСеротипХарактеристика271Вірулентний штам931вВакцинний штам1491аВірулентний для білих мишей, голубів, свиней. Контрольний заражаючий штам для мишей2512Вакцинний штам4191вВакцинний штам16892Вакцинний штам18932Вакцинний штам19331вВакцинний штамВР-2 вар. ІВМNАвірулентний вакцинний штам, клонований та селекціонований в ІВМ УААНМ-2 ВК2Вакцинний штам, клонований і селекціонований в ІВМ УААНКНетипо-ванийПольовий штам "Київський", виділений в Києво-Святошинському районі (Контрольний) ШНетипо-ванийПольовий штам "Шишацький", виділений в Шишацькому районі Полтавської області (Контрольний )
(Merck) та 0,02 г сульфату цинку (Merck) в 0,2 M натрієвому фосфатному буфері, води дистильованої до 1000 мл (рН середовища становило 7,6 ± 0,2) [60, 61].
Експериментальні варіанти живильних середовищ не містили сироватки, за винятком МПБХ.
Оскільки якість пептону є виключно важливим фактором при виготовленні високоякісних середовищ, для одержання поживних середовищ використовували пептон виробництва Becton Dickinson (США), який є одним з найкращих для отримання максимальної біомаси.
Середовища стерилізували шляхом фільтрації через стерилізуючі фільтри з діаметром пор 0,22 мкм (фільтр Millipore(r)). МПБХ стерилізували автоклавуванням при температурі 120?С протягом 30 хвилин, сироватку та розчин глюкози стерильно додавали перед використанням.
Пошук оптимального складу поживних середовищ проводили з використанням методики Адлер Ю.П. з співавт. [1]. Порівняльну оцінку контрольних та експериментальних середовищ здійснювали згідно з методичними вказівками [38].
Контроль концентрації водневих йонів (рН) проводили із застосуванням іонометру універсального відповідно до інструкції, наданої виробником.
Культивування бактерій бешихи у рідких поживних середовищах проводили при температурі (36,7±0,3)?С протягом 18-24 годин, а на твердих - 48-72 годин. Тинкторіальні властивості культур бакт