Изучение генетической вариабельности возбудителя сибирской язвы

2
ОГЛАВЛЕНИЕ
стр.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
1.ВВЕДЕНИЕ 6
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
2.1. Общая характеристика возбудителя сибирской язвы 11
2.1.1 .Диагностика сибирской язвы 12
2.1.2. Факторы патогенности возбудителя сибирской язвы 14
2.2. Классификация метод типирования бактерий 21
2.2.1. Фенотипические методы типирования микроорганизмов 22
2.2.2. Генотипические методы типирования микроорганизмов 26
2.2.3. Использование молекулярных маркеров для идентификации микроорганизмов 35
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАН^'.'"];' 43
3.1. Материалы 1 ‘: • 43
3.1.1. Штаммы 43
3.1.2. Ферменты и метки 43
3.1.3. Реактивы 43
3.1.3.1. Растворы 43
3.1.3.2. Среды 44
3.1.4. Лабораторное оборудование 44
3.2. Методы 45
3.2.1. Выделение ДНК из исследуемых бактерий 45
3.2.1.1. Выращивание бактерий 45
3.2.1.2. Выделение хромосомной ДНК 45
.3.2.1.3. Выделение плазмидной ДНК 46
3.2.2. Электрофоретическое разделение хромосомной и плазмидной ДНК и фрагментов рестрикции ДНК 46
3.2.3. Рестрикционный анализ ДНК 47
3.2.3.1. Перенос рестрикционных фрагментов на нитроцеллюлоз« ые фильтры 47
3.2.3.2. Радиоавто!рафия 47
3.2.4. Клонирование плазмидной ДНК 48
3.2.5. Постановка Г1ЦР 48
3.3. Результаты исследований 49
3.3.1. Клонирование фрагментов плазмидной ДНК возбудителя сибирской язвы в составе вектора рис 19 49
3.3.2. Идентификация В. агпЬгаОз с помощью ДНК-зонда на основе рекомбинантной плазмиды (Юх) 50
3.3.3. Идентификация сибиреязвенных штаммов методом полимеразной цепной реакции. 53
3.3.3.1. Разработка ПЦР для индикации возбудителя сибирской язвы 54
3.3.3.2. Генотипирование хромосомной ДИК бацилл с помощью П1 {Р 62
3.3.3.3. Анализ хромосомной ДНК бацилл с использованием праймеров, комплементарных инсерционному элементу 72
3.3.3.4. Анализ хромосомной ДНК бацилл с использованием праймеров, комплементарных рибосомальной ДНК 79
3.3.3.5. Исследование геномного полиморфизма штаммов возбудителя сибирской язвы методом риботипирования 81
4. ОБСУЖДЕНИЕ 87
5. ВЫВОДЫ 98
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 99
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 100
8. ПРИЛОЖЕНИЯ 1 15
10
Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 1 18 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, содержащий 37 отечественных и 94 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами, 16 рисунками и 1 приложением.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 1997-2000 г.г. в лабораториях “Биофизики” и “Экспериментальной микробиологии” ВНИ-ИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями НИР Российской академии сельскохозяйственных наук по теме 01.06. “Разработать генно-инженерные и иммунохимические методы идентификации и дифференциации возбудителей оспы овец и коз, чумы мелких жвачных, инфекционной бурсальной болезни, синдрома снижения яйценоскости, африканской чумы свиней, классической чумы свиней, сибирской язвы и листериоза”.
В выполнении отдельных разделов работы принимали участие: заведующий лабораторией “Экспериментальной микробиологии” ВНИИВВиМ кандидат биологических наук Селянинов Ю.О., старший научный сотрудник лаборатории “Биофизики”, кандидат биологических наук Цыбанова Л.Я., заведующий кафедрой микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Бурятской государственной сельскохозяйственной академии имени В.Р. Филиппова доктор ветеринарных наук, профессор Цыдыпов В.Ц., доцент кафедры микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Бурятской государственной сельскохозяйственной академии имени В.Р. Филиппова кандидат ветеринарных наук Муруева Г.Б., которым автор выражает искрению ю п ри знательность.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Общая характеристика возбудителя сибирской язвы.
Возбудитель сибирской язвы - Bacillus antracis. Относится к отряду Eubacterisales, семейству Bacillaceae, роду и подроду Bacillus.
Род Bacillus объединяет 48 видов аэробных или факультативно-аэробных бацилл, которые разделены на две группы: в первую включено 22 вида, во вторую - 26 видов.
Однако из многочисленной группы аэробных бацилл, обитающих в почве, только В. anthracis приобрела наиболее выраженные вирулентные свойства и способность вызывать у животных и человека болезнь со смертельным исходом.
В организме животного и при культивировании на питательных средах с большим содержанием нативного белка бациллы сибирской язвы образуют капсулу - наружный слизистый слой бациллы.
При неблагоприятных условиях существования бациллы образуют споры. Споры могут длительное время выживать в природе, а следовательно, долго сохранять генетический материал и тем самым обеспечивать передачу основных свойств потомству последующих генераций.
Устойчивость и длительность выживания бацилл и их спор различны. Бациллы сибирской язвы в мягких тканях невскрытого трупа могут сохраняться 2-4 сут. (18), а далее разрушаются иод воздействием протеолетиче-ских ферментов. Прямой солнечный свет убивает их за несколько часов. Бациллы сибирской язвы малоустойчивы к химическим веществам, чувствительны к действиям некоторых антибиотиков - пенициллина, стрептомицина, окситетрациклина, тетрациклина и биомицина.
Споры гораздо устойчивее, чем вегетативные формы бацилл, и во внешней среде сохраняются дольше. Высокая устойчивость спор к различ-