Содержание
Введение...............................................4
Глава I Влияние радиации на структуру и свойства
молекулы Л НК................................7
1. Действие ионизирующего излучения на конформацию молекулы ДНК.......................7
2. Влияние УФ-излучения на структуру
молекулы ДНК.....................................27
3. Конформация молекулы ДНК в растворе в присутствии неэлектролитов....................33
Глава II Материалы и методы..........................42
1. Элементы статистической теории полимерных цепей.........................................42
2. Основы теории вязкости и ее измерение...........45
3. Основы теории двойного лучепреломления в потоке и установка для измерений...................48
4. Исследование спектров УФ-поглощения и кругового дихроизма ДНК.......................56
5. Материалы.......................................57
6. Условия облучения...............................58
Глава III Результаты и обсуждение.....................61
1. Исследование конформационных изменений в молекуле ДНК, вызванных 7-облучением в водыо-этаыольных растворах....................61
2. Влияние мочевины на процесс радиационного поражения молекулы ДНК в растворе.............83
2
3. Исследование гидродинамических и оптических параметров УФ-облученной молекулы ДНК в растворе......................89
Выводы.............................................104
Литература.........................................105
3
Введение
Предлагаемая диссертационная работа посвящена изучению влияния 7- и УФ- облучения на гидродинамические, оптические и спектральные свойства молекулы ДНК в водных и водно-органических растворителях.
Актуальность темы.
К настоящему времени установлено, что при облучении организма именно повреждения молекулы ДНК играют решающую роль в процессах, приводящих клетки к мутациям и гибели. Изучая действие излучений на ДНК в модельных системах (водно-солевых растворах), можно получить важ-пую информацию о механизме повреждения макромолекулы в биологических структурах. Интерес к действию излучений различной природы на биологические объекты разного уровня организации обусловлен все возрастающим вниманием к экологическим проблемам. Такие исследования чрезвычайно актуальны в настоящее время в связи с развитием атомной промышленности, а также с изменением ряда геофизических факторов.
В диссертационной работе исследуется влияние 7-облучения на конформацию молекулы ДНК в водно-органических растворителях. Хорошо известно, что алифатические спирты способны защищать биологические макромолекулы от косвенного действия ионизирующего излучения путем перехвата активных радикалов, образующихся в результате радиолиза воды. Согласно современным представлениям, именно косвенное действие радиации вносит основной вклад в поражение биологических макромолекул 7-излучением как в клетке, так и в растворе. Помимо радио-протекторного действия, известно стабилизирующее влияние спирта на структуру воды при определенных его концентрациях. Напротив, мочевина, молекулы которой обладают большим дипольным моментом, даже при крайне малых концентрациях в растворе дестабилизирует структуру растворителя. Поэтому сравнение влияния этилового спирта и мочевины на радиационное поражение ДНК полез-
4
но для понимания роли некоторых свойств растворителя в изучаемом процессе.
В диссертационной работе проводится сравнение действия УФ- и 7-облучения на структуру и свойства молекулы ДНК. Эти излучения значительно отличаются по энергии. Кроме того, для УФ-света с длиной волны вблизи максимума поглощения ДНК характерно прямое действие радиации, в отличие от косвенного действия, преобладающего в случае 7-излучения. Несмотря на достаточно большое количество литературных данных о влиянии УФ- и 7-облучения на молекулу ДНК в растворе, к настоящему времени нет единого мнения о причинах наблюдаемых кон-формационных изменений. Предлагаемая работа посвящена определению молекулярных параметров ДНК в растворе после действия 7- и УФ-излучения при вариации дозы облучения, ионной силы и состава растворителя.
Целью работы является исследование конформацион-ных изменений ДНК в водно-органических растворителях, вызванных действием 7-радиации. В качестве сораствори-телей используются хорошо известный радиопротектор этиловый спирт, оказывающий стабилизирующее влияние на структуру воды, и мочевина, проявляющая дестабилизирующее действие на структуру растворителя. Для решения поставленной задачи исследования проводятся в широкой области концентраций неэлектролитов. В работе используются разные дозы облучения.
Целью диссертационной работы является также сопоставление влияния 7- и У Ф-облучения на структуру и свойства молекулы ДНК в растворе в широкой области ионных сил.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Она содержит 47 рисунков и 4 таблицы. Объем диссертации составляет 121 страницу. Список цитируемой литературы содержит 159 наименований.
Научная новизна.
Впервые исследовано влияние 7-облучения на конфор-мациоиные изменения ДНК в широкой области концентра-
5
ций неэлектролитов (этилового спирта и мочевины)) присутствующих в облучаемом водном растворе.
Обнаружено) что гидродинамические свойства, макромолекулы при ее облучении в присутствии спирта меняются сложным образом, причем характер зависимости характеристической вязкости облученной ДНК от концентрации этанола не зависит от молекулярной массы. Впервые показано, что облучение ДНК в во дно-этано льном растворе при Сэт < 20%вес. (весовых процентов) и дозах 10-30 Гр не оказывает заметного влияния на вторичную структуру и термодинамическую жесткость макромолекулы. Изучена дозовая зависимость характеристической вязкости ДНК при разных концентрациях этанола в облучаемом растворе.
Обнаружено, что в некоторой области концентраций спирта наблюдается инверсия дозовой зависимости удельного объема молекулы ДНК. Этот результат был получен для двух образцов ДНК, различающихся но молекулярной массе.
Впервые показано, что присутствие мочевины в облучаемом растворе малой ионной силы оказывает влияние на гидродинамическое поведение 7-0 б лученной ДНК, которое не связано с защитным или сенсибилизирующим действием этого сорастворителя.
Впервые показано, что влияние облучения УФ-светом с длиной волны 254 нм дозой 1,3*10_18Дж/нукл на объем молекулы ДНК не обусловлено изменением термодинамической ж е с тко с ти м ак р ом о леку л ы.
Практическая ценность.
Полученные в работе результаты представляют интерес для понимания механизма радиационного поражения ДНК. Они могут быть использованы в научных учреждениях, занимающихся исследованием влияния излучений различной природы и интенсивности на биологические объекты. Полученные результаты и выводы могут представлять интерес для разработок в области медицины, химической промышленности, а также при решении экологических задач.
б
Глава I Влияние радиации на структуру и свойства молекулы ДНК
1. Действие ионизирующего излучения на конформацию молекулы ДНК
К числу ИОНИЗИРЗ'ЮЩИХ относятся излучения различной природы, энергия которых достаточно велика, чтобы произвести ионизацию атомов. Для большинства элементов (Я, ЛГ, О, С\ 5, Р), из которых состоят биологические молекулы, при ионизации атомов необходимо затратить энергию около 10 эВ (потенциал ионизации). Этому значению энергии соответствуют излучения, попадающие по шкале электромагнитных волн в середину области ультрафиолетового излучения (Л = 120 - 180 нм), поэтому одна часть УФ-диапазона (так называемый ближний ультрафиолет) не является ионизирующим излучением, другая же его часть (дальний ультрафиолет) и более коротковолновые электромагнитные излучения: рентгеновское и 7-излучение радиоактивных изотопов — ионизируют вещество.
Наряду с ионизацией (отрывом электрона), все виды излучения вызывают возбуждение атомов вещества. Если энергия фотонов меньше потенциала ионизации атомов (Г,), то они не могут их ионизировать, но при определенных условиях переводят их в возбз'жденное состояние. Однако даже тогда, когда поглощенная молекулой энергия излучения равна или больше Е{, ионизация происходит далеко не всегда. Возможны перераспределение или потеря полученной избыточной энергии без ионизации.
Вероятность того, что ионизованные молекулы будут претерпевать дальнейшие химические изменения, весьма велика. Именно эти физико-химические процессы лежат в основе нарушения фз'нкционирования биологических систем. Основной характеристикой воздействия радиации на биологические системы является поглощенная доза £>. За поглощенную дозу принимается энергия излз'чения, пере-
гу
.
данная единице массы вещества. В настоящее время за единицу дозы принят 1 Дж/кг = 1 Грэй = 100 рад.
В клетке основной мишенью действия ионизирующего излучения является молекула ДНК [1-3], так как радиационные повреждения именно в структуре ДНК играют решающую роль в развитии реакций, приводящих клетку к мутациям и радиационной гибели.
Как известно, мономерными единицами ДНК являются нуклеотиды, содержащие фосфатную группу, остаток дез-оксирибозы и одно из четырех азотистых оснований: пуриновое - аденин (А) и гуанин (в), или пиримидиновое - цитозин (С) и тимин (Т). Нуклеотиды соединены друг с другом 3’,5’-фосфодиэфирноЙ связью (рис. 1).
Пятичленное кольцо сахара обычно непланарпо. В ДНК оно может принимать различные конформации в зависимости от свойств среды и состава ДНК [4] (рис. 2).
Представление о вторичной структуре молекулы ДНК с вытекающим из него механизмом деления клетки и передачи генетической информации, было предложено Уотсоном и Криком в 1953 году [5]. Согласно их модели, ДНК - двойная спираль с водородными связями между комплиментарными основаниями разных цепей (аденин - тимин, гуанин -цитозин) (рис. 3). Расстояния Су ... Су в обеих парах практически одинаковы. Связи Су—N и соответствующие сахарофосфатные остовы, находящиеся в антипараллельной ориентации (т. е. их 3’,5’- фосфодиэфирные связи ориентированы в противоположных направлениях), связаны псевдоосью симметрии 2-го порядка. Комплиментарность обеспечивает одинаковые поперечные размеры спирали (около 20А) на всем протяжении. Геометрия спирали такова, что на ее поверхности существуют два желобка - большой, ши-
<* в
риной около 20А и малый, шириной около 10А (рис. 4).
Двойная спираль ДНК также стабилизируется стэкинг-взаимодействием: основания образуют стоики под действием сил, возникающих между постоянными и индуцированными диполями оснований. В роли постоянного диполя, влияющего на тг-электронную систему соседних оснований.
8
Рис. 1. Участок цепи молекулы ДНК.
Е -С3.-ЭНДО
Е -С2.-ЭНДО
3Т -С2.-экзо-
С3-ЭНД0
(симметричная
конформация)
Зт2 -Сз-эндо-
Сг-экзо
(несимметричная
конформация)
Рис. 2. Возможные конформации сахара.
10
- Київ+380960830922