РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Реєстрація скорочувальної активності інтактних м’язових препаратів
Для реєстрації скорочувальної активності м’язових препаратів використовувалась
камера сконструйована провідним інженером відділу фізіології кровообігу І.О.
Назаруком [5]. Вона включає в себе перфузійну камеру, механоелектричний
перетворювач 6МХ1С, температурний датчик, нагрівальні елементи, розподільні
крани, воронки для подачі перфузійних розчинів (рис. 2.1). В прцесі виконання
роботи використовувалась система автоматичного контролю температури
перфузійного розчину, що дозволяла стабільно підтримувати температуру розчину в
камері з похибкою не більше 0,2 єС в діапазоні від 20 до 40 єС. Електричний
сигнал з виходу механоелектричного перетворювача реєстрували за допомогою
реєструючого пристрою КСП-4.
М’язовий препарат поміщали в камеру обґємом 1,5 мл., виготовлену з хімічно
неактивного плексиглазу.
В камері препарат кріпився в горизонтальному положення до двох гачків. Від
гачків виходять нитки таким чином, що один з них сполучений з механоелектричним
перетворювачем, а другий кріпиться через блок до вантажу, за допомогою якого
розтягується смужка. Для запобігання витікання розчину з камери нитки проходять
через фторопластові втулки. Обробка ниток воском та вазеліновим маслом дозволяє
зменшити коефіціент тертя та уникнути додаткової похибки при вимірюванні.
Рис. 2.1 Схема установки для реєстрації скрочення активності ізольованих
м'язових препаратів (6МХ1С – механоелектричний перетворювач, КСП-4 –
реєструючий пристрій).
Експерименти проводили на судинних препаратах ворітної вени та аорти, а також
препаратах папілярного м’язу щурів лінії Вістар-Кіото. В дослідах
використовували тварин віков 6-8 місяців та вагою 250-300 г. Після декапітації
та розтину черевної порожнини на два кінці ворітної вени накладали лігатуру та
виділяли її. Після цього, вену препарували, очищуючи від зґєднувальної тканини
та розрізали на 2-3 повздовжні сегменти довжиною 4-5 мм та шириною 0,5-1,0 мм.
Після цього обидва кінці звґязували лігатурою формуючи таким чином кільцевий
препарат. В необхідних випадках перед початком експерименту препарат
деендотелізували легким прокатуванням на фільтрувальному папері. Цей препарат
поміщали у термостатовану камеру, розтягували з силою 4-8 мН та залишали для
стабілізації режиму роботи на 30-40 хв. Камеру перфузували з швидкістю 2-3 мл
за хвилину стандартним розчином Кребса наступного складу: 133 мМ NaCl, 4,7 мМ
KCl, 16,3 мМ NaHCO3, 1,38 мМ NaH2PO4, 1,05 мМ MgCl2, 12 мМ глюкоза, 2,5 мМ
CaCL2, pH – 7,4.
Після розтину грудної порожнини виділяли грудний сегмент аорти довжиною 4-5 см.
Аорту також піддавали препаруванню та розрізали на кільцеві препарати товщиною
від 0,5 до 1,5 мм. Препарати відрізали під кутом 45є до повздовжньої осі
судини. В необхідних випадках препарати аорти також деендотелізували. Як і в
випадку ворітної вени, аорту поміщали в камеру, розтягували з силою 15-25 мН та
перфузували розчином Кребса. Період стабілізації для аорти був більший ніж для
ворітної вени і становив 1-1,5 год.
Папілярний м`яз вирізали із лівого шлуночка серця. Препарати довжиною 4-6 мм
поміщали в камеру, яку перфузували розчином Кребса та розтягували з силою 1-1,2
мН. Амплітуду скорочення в усіх випадках вираховували за величиною відхилення
реєструючого пристрою і оцінювали як відношення абсолютної амплітуди скорочення
до маси препарату.
Препарати ворітної вени мали міогенну скорочувальну активність, що мала вигляд
періодичних фазних скорочень. Частота власних скорочень препаратів ворітної
вени становила 4-6 хв-1, а амплітуда скорочень – 0,8-1,0 мН/мг. Наявність таких
скорочень і була контролем діяльності препарату. Контролем інтактності
скорочувального апарату препаратів аорти та папілярного м’язу була
скорочувальна реакція препарату у відповідь на пефузію камери гіперкалієвим
розчином (100 мМ), який готувався еквімолярною заміною іонів Na+ на К+ в
розчині Кребса.
2.2. Реєстрація скорочувальної активності м’язових препаратів, скінованих за
допомогою сапоніну
Скіновані препарати є зручною моделлю для вивчення властивостей
скорочувального апарату мґязевої тканини. Загальною властивістю усіх скінованих
препаратів є відсутність або часткове ушкодження плазматичної мембрани в
результаті чого внутрішньоклітинне середовище отримує змогу обмінюватись іонами
з зовнішнім середовищем. В таких препаратах склад внутрішньоклітинного
середовища визначається лише складом оточуючого розчину, в результаті чого
зґявляєтся можливість строгого контролю оточуючого середовища, і, зокрема
концентрації Са2+ та безпосереднього доступу різних молекул (у тому числі і
великих за молекулярною масою) до скорочувального апарату.
Вперше таку методику було застосовано для скелетних мґязів [235]. В цих
експериментах для дослідження скорочень без участі мембранних механізмів
регуляції [Са2+]і використовували глицеринізовані препарати скелетних мґязів.
Ця методика широко застосовувалась для дослідження властивостей скорочувального
апарату скелетних та серцевого мґязів, але для ГМ її застосування було досить
обмеженим. Кінетика скорочення в таких препаратах не співпадала з тою, що існує
в інтактних препаратах. Зокрема, в гліцеринізованих препаратах ГМ швидкість
наростання механічної напруги після додавання АТФ була набагато меншим у
порівнянні з інтактними препаратами [32, 60, 168].
Наступним етапом у розвитку методики скінованих препаратів стало застосування
механічних методів пошкодження плазматичної мембрани. [89, 171, 196]. Перевагою
цього методу, порівняно з попереднім, було те, що за своїми скорочува
- Київ+380960830922