Ви є тут

Механізми модулюючої дії NO на скорочення та К+-канали мембрани міоцитів сонної артерії щура

Автор: 
Цвіловський Володимир Валерійович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2002
Артикул:
3402U001337
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МЕТОДИКА
2.1. Реєстрація скоротливої активності гладеньких м'язів
В дослідах використовувались щури обох статей вагою 200-300г. Тварин присипляли за допомогою ефіру, а потім декапітували. Дослідження проводилося на деендотелізованих спіральних смужках з arteria carotis communis та arteria carotis interna щура 8 мм завдовжки і 1 мм завширшки. Смужка кріпилася в експериментальній камері за допомогою шовкових лігатур. Під час експерименту м'язова смужка знаходилась в проточній термостатованій камері. Температура проточного розчину в робочій камері фіксувалася на рівні 36.5° С. Об'єм робочої камери складав 300 мкл, швидкість перфузії 2 мл за хвилину.
Скоротливу активність гладеньком'язових смужок реєстрували в режимі близькому до ізометричного за допомогою напівпровідникового механоелектричного перетворювача, до важілю якого кріпили лігатуру смужки. Блок-схему тензіометричної установки зображено на Рис. 2.2. Після вміщення гладеньком'язової смужки у камеру їй надавалося пасивне напруження 800 мг. Після зарядки смужку витримували в установці до початку експерименту не менше 30 - 60 хвилин. Експеримент починали тоді, коли смужка починала давати скорочення постійної амплітуди на гіперкалієвий розчин. В якості записуючого пристрою використовували автоматичний потенціометр КСП-4.

2.2. Виділення ізольованих міоцитів

Дослідження проводили на поодиноких гладеньком'язових клітинах, ізольованих з загальної сонної артерії щура. В дослідах використовувались тварини обох статей вагою 200 - 300г. Поодинокі клітини отримували методом ферментативно-механічної ізоляції. Очищені від сполучної тканини шматочки артерій розрізали вздовж та поміщали в бюкс зі свіжим розчином Кребса і тримали при температурі 10-15 ?С. Впродовж 30 хвилин розчин 3-4 рази замінювався на свіжий.
Рис. 2.1. Блок-схема тензіометричної установки:
1. - Сіліконова трубка для подачі фізіологічного розчину;
2. - Робоча камера установки;
3. - Гладеньком'язова смужка;
4. - Перистальтичний насос;
5. - Сіліконові трубки для подачі підігрітої води;
6. - Термостат;
7. - Механоелектричний перетворювач сила-напруга;
8. - Електричний підсилювач сигналів;
9. - Автоматичний потенціометр КСП-4 (самописець);
10. - Фізіологічний розчин.
Далі розчин впродовж 30 хвилин поступово заміщувався на розчин для виділення (частковим зливанням старого розчину і доливанням нового). Після цього шматочки артерій переносили в бюкс з 3-ма мл розчину для виділення, що містив 2 мг папаїну, та 2 мг бичачого сироваткового альбуміну. В цьому розчині шматочки тканини інкубували на протязі 3-5 годин при температурі 5 оС. Після інкубації бюкс з шматочками тканини витягали з холодильника і тримали при кімнатній температурі 10-15 хвилин, після чого додавали 0.5 мг дітіотриетолу і тримали в термостаті при температурі 36-37 оС 20 хвилин (при періодичному зтрушуванні та помішуванні). Як правило за цей час довжина шматочків тканини збільшувалась в 1.5-2 рази. Далі останні двічі відмивали в розчині для виділення і нарізали на шматочки квадратної форми. Функціонально повноцінні ізольовані міоцити артерій отримували шляхом багаторазового пропускання шматочків артерій через пастерівську піпетку в свіжому розчині для виділення, який містив 0.03% бичачого сироваткового альбуміну. Помутніння цього розчину свідчило про виділення ізольованих міоцитів. На протязі екперименту ізольовані міоцити зберігали в цьому ж розчині при температурі 5 оС.
Ізольовані міоцити сонних артерій мали високий вхідний опір (1-5 ГОм), зберігали всі компоненти іонних провідностей, які характерні для нативної мембрани, скорочувались у відповідь на прикладення гіперкалієвого розчину. Ці показники свідчили про те, що мембрана та скорочувальний апарат ізольованих міоцитів зберігся в нормальному функціональному стані.

2.3. Електричні вимірювання
Для вимірювання трансмембранних іонних струмів ізольованих гладеньком'язових клітин було використано методику фіксації потенціалу ("patch-clamp") [177].
Для проведення досліджень суспензію клітин поміщували в експериментальну камеру об'ємом 500 мкл із скляним дном яка прикріплена до столика інвертованого мікроскопа. Через 5-7 хвилин починали перфузію зовнішнім розчином, при цьому в камері залишались тільки клітини, які закріпились на її дні. Для дослідів вибирали розслаблені видовжені клітини із гладкою поверхнею. Досліджувані речовини додавали до зовнішнього розчину в концентраціях, які вказані в тексті. Розчини в робочій камері під час експерименту замінювалися поступово, (на протязі - 4-6 секунд розчин в камері замінювався повністю). Досліди проводились при кімнатній температурі (22-24 оС). Фіксація потенціалу та реєстрація струмів здійснювилась за допомогою підсилювача PATCH-CLAMP L/M EPC 5 з опором зворотнього звязку перетворювача струм-напруга 500 МОм. Сигнал з виходу підсилювача потрапляв через фільтр низьких частот (частота зрізу 1 кГц) на аналого-цифровий перетворювач Digidata 1200A (Axon Instruments) та далі в комп'ютер ІВМ РС/АТ. Дані аналізувались за допомогою програми "pCLAMP 5.5".

2.3.1. Витягування мікропіпеток.
Мікропіпетки для вимірювання інтегральних іонних струмів виготовляли із м'якого молібденового скла за методикою описаною в роботі [16]. Витягування мікропіпеток проводилось в одну стадію за допомогою модифікованої кузні МЕ-4. На кінцевій стадії проводили теплову поліровку кінчиків мікропіпеток. Опір мікропіпеток, заповнених розчинами В, Г та Д становив 1-3 МОм.
Для дослідження струмів поодиноких каналів мікропіпетки покривали воском для зниження паразитної ємності піпетки при опусканні її у розчин.
2.3.2. Дослідження інтегральних іонних струмів.
Для дослідження інтегральних іонних струмів від мембрани цілої клітини використовували "whole-cell" конфігурацію методу "patch-clamp", її принцип полягає в утворенні щільного (гігаомного) контакту між стінками піпетки і мембраною клітини (конфігурація "cell-attached"). На наступному етапі ді