РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Досліджувані речовини та рослинні об'єкти
В роботі були використані фукозовмісні олігосахарини, які були отримані з жіночого молока в Інституті елемент-органічних сполук ім. О.Н. Несмеянова, РАН, у лабораторії Ямскова І.А. Піскарьовим В.Є, (додаток Б):
FG - фукозилгалактоза
Fuc-?-Gal-?;
FGN - N-ацетилфукозилглюкозамін
Fuc-?-GlcNAc-?;
DFL - дифукозиллактоза
Fuc-?(1>2)Gal-?(1>4)Glc(3>1)Fuc-?;
FGGn-ol - фукогалактозилгалакто-N-ол
Fuc-?-(1>2)Gal-?(1>3)GalNAc-ol;
LNFP 1 - лакто-N-фукопентаоза-1
Fuc-?(1>2)Gal-?(1>3)GlcNAc-?(1>3)Gal-?(1>4)Glc;
LNFP 2 - лакто-N-фукопентаоза-2 - Lewis-а пентасахарид
Gal-?(1>3)[Fuc-?(1>4)]GlcNAc-?(1>3)Gal-?(1>4)Glc;
LNFP 3 - лакто-N-фукопентаоза-3
Gal-?(1>3)GlcNAc-?(1>3)[Fuc-?(1>3)]Gal-?(1>4)Glc ;
LNDFH 1 - лакто-N-дифукозилгексаоза 1 - Lewis-b гекасахарид
Fuc-?(1>2)Gal-?(1>3)[Fuc-?(1>4)]GlcNAc-?(1>3)-Gal-?(1>4)Glc;
DFLNH(b) - дифукозиллакто-N-гексаоза(b)
Gal-?(1>4)[Fuc-?(1>3)]GlcNAc-?(1>6)[Glc(4>1)]Gal-?(3>1)[Fuc-?(1>4)]GlcNAc-?(3>1)Gal-?;
TFLNH - трифукозиллакто-N-гексаоза
Gal-?(1>4)[Fuc-?(1>3)]GlcNAc-?(1>6)[Glc(4>1)]Gal-?(3>1)[Fuc-?(1>4)]GlcNAc-?(3>1)[Fuc-?(1>4)]Gal-?;
LNT - лакто-N-тетраоза
Gal-?(1>3)GlcNAc-?(1>3)Gal-?(1>4)Glc;
Лакто-N-тетраоза - олігосахарин, який не містить фукозу, використовували для з'ясування залежності біологічної активності олігосахаринів від наявності фукозильного залишку. Фукогалактозилгалакто-N-ол - єдиний відновлений олігосахарин, отриманий з крові свиней, досліджували для визначення різниці біологічної активності відновлених та невідновлених олігосахаринів.
Лакто-N-фукопентаози 2 та 3, лакто-N-дифукозилгексаоза 1, крім того, що вони містяться у жіночому молоці, відносяться до антигенів системи крові Lewis. Відомі 14 самостійних систем груп крові, що включають більш 60 різних антигенів. Із системою АВО (4 групи крові) подібна система Lewis, які характеризується присутністю антигенів Lea і Leb [42]. У тканинних рідинах і секретах можуть виявлятися в розчинній формі п'ять групових речовин - А, В, Н, Lea і Leb, що є продуктами трьох незалежних систем генів АВО, Нh, Lele. При гідролізі мінеральними кислотами з гідролізатів аглютинінів А, В, Н, Lea виділені й ідентифіковані олігосахариди, які мають антигенну активність цих груп крові [42]. У апараті Гольджи рослин та тварин знайдені гомологічні рецептори зв'язування N-гліканів [181]. У рослинах виділено N-глікани, які містять Lewis-а антиген (фукозиллактозу), що може бути пов'язано з міжклітинною взаємодією [100]. N-глікани, з фукозиллактозою знайдені у багатьох видів однодольних, дводольних та голонасінних рослин [122].
В якості об'єктів досліджень використовували проростки та експланти мікропагонів, сім'ядолей та гіпокотилів томату (Lycopersiсon esculentum Mill., сорт Новичок), проростки озимої пшениці (Triticum aestivum L., сорт Херсонська 86), сім'ядолі та сегменти гіпокотилів огірків (Cucumis sativus L., сорт Парад), ендосперми ячменю (Hordeum sativum Lessen., с. Южний), сім'ядолі сої (Glycine max (L.) Merr., Юг 30).
Активність олігосахаринів, отриманих з жіночого молока, вивчали у біотестах, специфічних для ауксину та цитокініну, тестах на амілолітичну активність та синтез фітоалексинів. Також проводили дослідження впливу на проростання насіння, в залежності від способу обробки, ріст та розвиток проростків та експлантів in vitro. З'ясовували вплив олігосахаринів з жіночого молока, що містять фукозу, на стійкість рослин до фітопатогенів та стресів, викликаних різними факторами.
Схема досліджень представлена на рисунку 2.1.
2.2. Умови асептики та стерилізація рослинного матеріалу
Стерилізація живильних середовищ, стерилізація рослинних об'єктів отримання та культивування рослинного матеріалу проводились по загальноприйнятим у біотехнології методикам [3-5, 19, 21, 28]. Усі роботи проводили у стерильних умовах ламінарного боксу. Живильні середовища стерилізували протягом 20 хв. у автоклаві ГК-100 при температурі 120?С та тиску 1,5 атм. Розчини фукозовмісних олігосахаринів автоклавували окремо, так як при високих температурах у кислому середовищі вони гідролізуються. Потім, в умовах ламінарного боксу їх змішували з середовищем. Для одержання асептичних проростків насіння томату, озимої пшениці та огірків стерилізували шляхом послідовної обробки 0,1 % розчином калій перманганату (2 хв.), 96 % етиловим спиртом та 4 % розчином кальцій гіпохлориту (15 хв.) з наступним трикратним промиванням стерильною дистильованою водою.
2.3. Вплив фукозовмісних олігосахаринів на експланти томату in vitro
Після стерилізації насіння висаджувалось у пробірки з середовищем Мурасіге-Скуга [160] без фітогормонів (табл. 2.1). Асептичні проростки тримали у культуральному приміщенні при 25? С та 16 годинному фотоперіоді протягом одного місяця. Після цього з цих проростків вичленяли експланти та вводили їх на живильне середовище Мурасіге-Скуга з фітогормонами для експлантів сім'ядолей та гіпокотилів та без фітогормонів - експланти мікропагонів. У середовище додавали олігосахарини у концентраціях 10-15, 10-13, 10-11, 10-9, 10-7 моль/л.
Объект
Рис. 2.1. Схема дослідження
Потім його розливали у колби по 35 мл для культивування експлантів сім'ядолей та гіпокотилів або пробірки по 5 мл - для експлантів мікропагонів. Експланти сім'ядолей та гіпокотилів культивували протягом шести тижнів, мікропагонів протягом чотирьох тижнів при 25? С та 16 годинному фотоперіоді. Після культивування визначали частоту регенерації та ризогенезу, інтенсивність наростання калусу, індукованого з експлантів сім'ядолей та гіпокотилів; висоту пагону, довжину та кількість коренів і масу регенерантів, отриманих з мікропагонів.
Таблиця 2.1
Склад живильного середовища Мурасіге-Скуга (1962) [160]
КомпонентиКонцентрація, мг/лКомпонентиКонцентрація, мг/лKNO3
КН2РО4
NH4NO3
MgSO4·7Н2О
СаСl2