РАЗДЕЛ 2
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объект исследования. Общая характеристика сенсорных нейронов заднекорешковых спинальных ганглиев
Первичные сенсорные нейроны млекопитающих представляют собой псевдоуниполярные клетки, которые находятся в спинальных заднекорешковых ганглиях или в узлах черепно-мозговых нервов. В зарубежной литературе эти клетки получили название DRG нейронов (dorsal root ganglion neurons). Отростки этих нейронов осуществляют рецепцию внутренних и внешних раздражителей и передачу возбуждения к вторичным сенсорным нейронам центральной нервной системы, находящимся в задних рогах спинного мозга или в ядрах Голля и Бурдаха продолговатого мозга. В зависимости от размера сомы нейроны спинальных ганглиев делят на большие (диаметр сомы 45-51 мкм), малые (диаметр сомы 20-27 мкм), а также средние нейроны с диаметром сомы 33-38 мкм, выделяемые некоторыми авторами как отдельная группа [156]. Существует корреляция между размерами сомы нейронов спинальных ганглиев и скоростью проведения потенциала действия по их аксонам. Нейроны спинальных ганглиев делят на быстропроводящие большие нейроны со скоростью проведения более 14 м/с и медленнопроводящие малые нейроны со скоростью проведения меньше 8 м/с. В зависимости от типа аксона нейроны делят на А клетки (большого диаметра) и С клетки (малого диаметра). Считают, что со скоростью проведения потенциала действия по аксону тесно связана модальность нейронов спинальных ганглиев и быстропроводящие A? и А? волокна, идущие от кожи и мышц передают в основном тактильную и проприоцептивную информацию, тогда как медленнопроводящие A? и С волокна обеспечивают температурную и болевую чувствительность. Таким образом, спинальные заднекорешковые ганглии теплокровных состоят минимум из двух групп клеток, обеспечивающих ноцицептивную и неноцицептивную чувствительность. Идентифицировать первичные сенсорные нейроны как неноцицептивные А клетки или ноцицептивные С клетки можно по размерам сомы сенсорных нейронов. Известно, что только в нейронах большого диаметра эндоплазматический ретикулум непосредственно участвует в регуляции внутриклеточного кальция, тогда как в нейронах малого диаметра подобного участия не обнаружено [44,58].
В наших экспериментах тип нейронов определялся визуально по диаметру изолированных клеток. Чтобы минимизировать возможную ошибку, в качестве больших клеток выбирались клетки с диаметром более 45 мкм, а в качестве малых - менее 25 мкм, при этом дополнительный контроль осуществлялся с помощью сравнения характера кальциевых ответов на деполяризацию, которые заметно отличались в двух данных группах нейронов (см. результаты).
2.2. Метод ферментативного выделения сенсорных нейронов
Эксперименты, описанные в данной работе, выполнялись на свежеизолированных нейронах заднекорешковых ганглиев месячных крыс и мышей. Для получения изолированных клеток использовалась стандартная процедура ферментативной изоляции. Животное декапитировали под легким эфирным наркозом и выделяли грудные и поясничные спинномозговые ганглии, которые помещали в охлажденный до 4°С раствор Тироде на 15-20 минут (состав растворов приведен ниже). После отмывания ганглии переносили в покрытый силиконом пенициллиновый флакон с 2 мл подогретого до 36°С раствора Тироде с добавлением 1 мг/мл протеазы (тип XIV, Sigma, США) и 0,5 мг/мл коллагеназы (Worthington, США) и выдерживали при указанной температуре в течение 30 минут, обеспечивая постоянное перемешивание раствора. После ферментативной обработки ганглии отмывали не содержащим ферменты раствором Тироде той же температуры в течение 20 минут. Для получения клеточной суспензии ганглии пипетировались с помощью стеклянных оплавленных Пастеровских пипеток в течение 5 минут в 0,5 мл раствора Тироде. Полученную суспензию разливали в пластиковые чашки Петри диаметром 35 мм (Nunc, Дания) и выдерживали в термостате при 36°С в течение 1 часа для прикрепления клеток ко дну чашек. Клетки использовались в эксперименте в течение 6-8 часов после выделения. Контрольные эксперименты показали, что изолированные таким методом нейроны сохраняют свои основные характеристики в течение 24 часов.
2.3. Метод получения экспериментального диабета
В модели экспериментального диабета мы использовали самцов крыс линии Вистар в возрасте 21 постнатального дня. Диабет вызывался одной внутрибрюшинной инъекцией стрептозотоцина, растворенного в 0,9 процентном растворе NaCl (изотонический 0,9% раствор для инъекций, Галичфарм, Львов, Украина), в количестве из расчета 80 мг на 1 кг веса животного.
Контрольные и стрептозотоцин-инъецированные животные такого же возраста содержались в одинаковых условиях на протяжении всего периода развития заболевания. Для так называемого стрептозотоцинового контроля часть животных бралась в эксперимент через один день после инъекции стрептозотоцина. Исследования, проведенные на данной группе животных, не выявили отличий в кальциевой сигнализации по сравнению с контрольными неинъецированными животными, поэтому данная группа не была включена в общую статистику и в дальнейшем не рассматривалась. Экспериметны проводились на животных через 3-4 недели после инъекции стрептозотоцина.
Концентрация глюкозы в плазме крови, взятой из хвостовой вены, измерялась при помощи оптического сенсора глюкозы Глюкотренд (Roche Diagnostics GmbH., Mannheim, Германия). Уровень глюкозы больных животных в среднем составлял 21(1 мМ (n=39). Уровень глюкозы в крови контрольных животных составлял 7(2 мМ (n=36).
Эксперименты с животными были утверждены и проводились в соответствии с требованиями Клиники подопытных животных Института физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины.
2.4. Экспериментальный метод проверки наличия нейропатии
2.4.1. Измерение изменений болевой чувствительности. Формалиновый тест. Чтобы показать наличие нейропатий у отобранных диабетических животных, ми провели ряд опытов по исследованию их болевой и термической чувствительности. Формалиновый тест является одним из стандартных тестов для
- Київ+380960830922