РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Експериментальна частина роботи виконана на курчатах і курях яєчного кросу "Tetra-SL", які вирощувались в умовах птахофабрики "Львівська" (с. Заводське, Буського району Львівської обл.) і спілки селянських господарств "Городоцька" (с. Бартатів, Городоцького району Львівської обл.).
Дослідження проводились протягом 1999-2000 років в лабораторії біології росту і розвитку Інституту біології тварин Української академії аграрних наук.
З метою вивчення особливостей обміну ліпідів у курей і деяких факторів його регуляції було проведено дві серії дослідів.
2.1. Дослідження вікових особливостей обміну ліпідів в органах і тканинах курей
Перша серія дослідів була скерована, з одного боку, на дослідження вмісту ліпідів і співвідношення окремих їх класів у печінці, грудному м'язі, шкірі та жирнокислотного складу загальних ліпідів печінки, з другого - на дослідження інтенсивності синтезу ліпідів у печінці, грудному м'язі, слизовій оболонці порожньої кишки, шкірі і яєчнику курей у 30-, 60-, 120-, 180-, 300-денному віці при використанні в якості попередників ліпідів мічених радіоактивним вуглецем оцтової і пальмітинової кислот в умовах in vitro, а також на з'ясування ступіня використання вказаних сполук у енергетичних процесах.
Для біохімічних досліджень були використані зразки вказаних органів і тканин, одержані від 30-, 60-, 120-, 180-, 300-денних курей яєчного кросу "Tetra-SL" відразу після їх забою, який проводили шляхом декапітації. Птиця утримувалась в умовах спеціалізованого господарства (птахофабрики) і одержувала стандартний комбікорм, який забезпечував її потребу в основних елементах живлення згідно деталізованих норм [187, 188]. Від 5- до 30-денного віку згодовували комбікорм ПК 2-6, від 31- до 90-денного віку - ПК 3-4, у віці 91-150 днів - комбікорм ПК 4-4, зі 151-денного віку - ПК 1-18.
Зразки тканин одержували приблизно через 5 хв. після забою птиці, обмивали їх холодним фізіологічним розчином і підсушували фільтрувальним папером. Частину тканини, в якій визначали загальний вміст ліпідів, їх жирнокислотний склад і співвідношення окремих класів, заморожували у рідкому азоті і зберігали до початку аналізів. Іншу частину тканини використовували для дослідження синтезу ліпідів. Її обмивали холодним 0,9% розчином NaCl, підсушували фільтрувальним папером і до початку досліджень (10-15 хвилин) зберігали у термосі з льодом.
2.1.1. Визначення вмісту загальних ліпідів в органах і тканинах курей. Зразки органів і тканин, в яких визначали загальний вміст ліпідів і співвідношення їх окремих класів, розтирали на порошок у рідкому азоті. Загальні ліпіди з тканини екстрагували сумішшю хлороформ-метанолу у відношенні 2:1 за методом Фолча [189]. При цьому до однієї вагової частини тканини додавали 20 частин екстрагуючої суміші, ретельно струшували і залишали на 12 годин для екстракції. Неліпідні домішки з екстракту видаляли шляхом відмивання їх 0,74М розчином KCl . Кількість ліпідів у тканині визначали ваговим методом після відгонки екстракційної суміші [190].
2.1.2. Визначення вмісту окремих класів ліпідів в органах і тканинах курей. Розділення ліпідів на окремі класи проводили методом висхідної одномірної тонкошарової хроматографії в герметичних камерах на скляних пластинках, покритих сумішшю силікагелю марок L 5/40 і LS 5/40 "Chemapol" (Чехія). Рухомою фазою служила суміш гексану, диетилового ефіру і льодової оцтової кислоти у відношенні 70:30:1. При цьому виявлялись: фосфоліпіди, моно-, ди- і триацилгліцероли, неетерифіковані жирні кислоти, вільний і ефірнозв'язаний холестерол [191]. Одержані хроматограми проявляли у камері, насиченій парами йоду. Для ідентифікації окремих класів ліпідів використовували специфічні реагенти і очищені стандарти. Кількість неполярних ліпідів визначали біхроматним методом [192]. Плями ліпідів разом з силікагелем переносили в центрифужні пробірки, додавали 0,25 мл 1Н розчину біхромату калію і 0,4 мл концентрованої сірчаної кислоти. Пробірки нагрівали 20 хв. у дюралюмінієвому блоці при температурі 140°С, потім охолоджували і додавали 1,2 мл дистильованої води. Силікагель осаджували центрифугуванням. Інтенсивність забарвлення проб визначали на спектрофотометрі "Spekol 220" (Німеччина), при довжині хвилі 615 нм проти контрольної проби.
Вміст фосфоліпідів в органах і тканинах визначали за кількістю фосфору в ліпідному екстракті. В центрифужні пробірки вносили екстракт ліпідів в об'ємі, що відповідає 0,02 г тканини або 0,01 г яєчного жовтка, додавали по 0,6 мл 72% хлорної кислоти і нагрівали у дюралюмінієвому блоці при 180°С. Після охолодження у пробірки послідовно додавали 4 мл дистильованої води, по 0,2 мл сульфіт-сульфонового реактиву (15 г метабісульфіту натрію, 0,5 г сульфіту натрію і 0,25 г 1-аміно-2-нафтол-4 сульфонової кислоти (ейконогена), розчинених у 100 мл бідистильованої води), і по 0,2 мл 5% розчину молібдату амонію. Пробірки закривали і поміщали на водяну баню на 10 хв. Поглинання проб вимірювали на вказаному спектрофотометрі при довжині хвилі 830 нм проти контролю. Кількість фосфору у пробі визначали за стандартною калібрувальною кривою. Для перерахунку на фосфоліпіди знайдену кількість ліпоїдного фосфору множили на коефіцієнт 25 [193].
2.1.3. Дослідження жирнокислотного складу загальних ліпідів печінки курей. З метою визначення жирнокислотного складу загальних ліпідів печінки курей їх метилювали шляхом прямої переетерифікації жирних кислот [191]. Для цього досліджувані ліпіди розчиняли в хлороформі і в кількості 10-20 мг переносили в скляні ампули, де під струменем азоту розчинник випаровували, а до залишку додавали 1 мл бензолу і 2 мл 5-7% HCl в абсолютному метанолі. Ампули запаювали і поміщали у термостат на 48 год. при температурі 72°С. Після чого ампули розкривали, додавали 2-3 краплі індикатора - 0,05% бромтимолового синього у 20% розчині метанолу і 2-3 мл насиченого розчину вуглекислого натрію. При цьому колір індикатора