РОЗДІЛ 2
ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Враховуючи мету і завдання, поставлені в дисертаційній роботі, а також сучасні
уявлення про патогенез і принципи лікування токсичних уражень печінки, нами
вибрано наступний методологічний підхід та комплекс лабораторних методів
дослідження.
2.1. Відбір тварин для дослідження
Дослiди проведені на білих безпородних щурах-самцях, якi утримувалися на
стандартному рацiонi вiварiю. В процесі роботи використано 420 тварин. В
експерименті досліджували щурів трьох вікових груп: 3-місячного віку (період
статевого дозрівання; молоді), 6-місячних (період статевої зрілості; дорослі) і
18-24-місячних (період старості; старі) [309].
Кадмієвий токсикоз викликали шляхом одноразового внутрішньочеревного введення
кадмій хлориду, який попередньо розводили на 0,9 % розчині натрій хлориду, з
розрахунку 7 мг/кг маси тіла тварини, що становить 1/12 DL50 [310]. Інтактним
тваринам внутрішньочеревно вводили відповідну кількість 0,9 % розчину NaCl.
Щурів декапітували під легким ефірним наркозом на 1-у, 4-у, 7-у і
14-у доби з моменту інтоксикації. Об’єктом дослідження служили плазма крові,
мітохондрії гепатоцитів і гомогенат печінки.
Всі піддослідні тварини були поділені на 5 груп: І - інтактні щури; ІІ -
тварини, уражені кадмій хлоридом; ІІІ - щури, уражені кадмій хлоридом, яким
вводили розчин прополісу; ІV - щури, яким застосовували для корекції кадмієвої
інтоксикації поєднання прополісу і ентеросорбенту “Фібрабет”; V - тварини з
кадмієвою інтоксикацією, ліковані холінфосфатидними ліпосомами з
інкапсульованими цитохромом с і манітолом.
Прополіс вводили щоденно перорально у вигляді 10 % спиртового розчину з
розрахунку 250 мг/кг маси тіла через 24 год після ін’єкції кадмій хлориду
протягом усього досліду [311].
Ентеросорбент “Фібрабет” - вводили тваринам внутрішньошлунково із розрахунку 1
г/кг маси тіла щоденно протягом усього експерименту через 24 год після введення
прополісу. Даний сорбент створено на кафедрі медичної хімії Тернопільської
медакадемії проф. Я.І. Гонським. Він являє собою біологічно-активну добавку,
одержану з насінневих оболонок пшениці (висівки) та гречки, насіння льону,
білої глини (каоліну) та соку буряка столового. Крім сорбуючих речовин, в
своєму складі він також містить вітаміни та мікроелементи.
Суспензію холінфосфатидних ліпосом з інкорпорованими цитохромом с (0,11 мг на
100 мг ліпідів) і манітолом (0,2 мг на 100 мг ліпідів) вводили
внутрішньочеревно щоденно в дозі 100 мг/кг протягом усього досліду [274].
Всі експерименти на тваринах проводили у відповідності з “Правилами
використання лабораторних експериментальних тварин”.
2.2. Методи дослідження інтенсивності процесів ліпопероксидації
2.2.1. Вивчення iнтенсивностi спонтанної та iнiцiйованої хемiлюмiнесценцiї
(ХЛ).
Для реєстрацiї спонтанного надслабкого випромiнювання ми використовували
квантометричну установку, детектором в якiй служив фотоелектронний помножувач
ФЕП-39А, термостатований при +15 оС.
Інтенсивнiсть ХЛ визначали при температурi 37 оС. Як блок iндикацiї
використовувався електронно-обчислювальний пристрiй ПР-14М, за допомогою якого
можна отримувати цифрову iнформацію в iмпульсах за певний час, а також вести
графiчне вiдображення процесу на самописцi КСП-4. Перед i пiсля кожного
дослiдження перевiряли фон установки. Інтенсивнiсть спонтанної ХЛ визначали
таким чином: у термостатовану кювету вносили 4,5 мл 0,02 моль/л фосфатного
буферу (рН=7,4), додавали 0,5 мл плазми кровi (без гемолiзу) або гомогенату
печiнки (1 : 10, на iзотонiчному розчинi) i записували рiвень свiтiння.
Iнтенсивнiсть спонтанної ХЛ виражали в умовних одиницях [312].
Для пiдвищення iнформативностi методу використовували iнiцiювання ХЛ пероксидом
водню [313]. Дослiдження проводили в такiй послiдовностi: реєстрували спонтанну
ХЛ, як описано вище; в кювету вводили 0,5 мл 3 % розчину перекису водню i
реєстрували динамiку iнтенсивностi світіння на самописцi до виходу кривої
свiтiння на стацiонарний рiвень. За допомогою лічильника імпульсів фiксували
свiтлосуму iнiцiйованої ХЛ за 200 секунд. Амплiтуду спалаху ХЛ пiсля введення
Н2О2 визначали шляхом вимiрювання вiдстанi вiд рiвня фону до верхнього рiвня
свiтiння. Свiтлосуму i амплiтуду спалаху ХЛ виражали в умовних одиницях.
Визначали також коефiцiєнт стимулювання ХЛ пероксидом водню, як частку вiд
дiлення амплiтуди спалаху iнiцiйованої ХЛ на амплiтуду спонтанної ХЛ.
2.2.2. Метод визначення вмісту малонового діальдегіду (МДА).
Принцип методу полягає у здатності малонового діальдегіду при взаємодії з
тіобарбітуровою кислотою в кислому середовищі утворювати забарвлений комплекс
[126].
Вміст МДА визначали в плазмі або 10 % гомогенаті печінки. До 1 мл 10 %
гомогенату або до 0,5 мл плазми крові додавали 1 мл дистильованої води, 2 мл 30
% розчину трихлороцтової кислоти, 0,2 мл 5 моль/л р-ну HСl , 2 мл 0,8 %
тіобарбітурової кислоти і кип’ятили 15 хв на водяній бані. Проби охолоджували,
осад відділяли центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 10 хв. Вимірювали
оптичну щільність супернатанту на спектрофотометрі СФ-46 при l=535 нм проти
води. Розрахунок проводили, враховуючи коефіцієнт молярної екстинкції для МДА,
який дорівнює
1,56Ч105 мольЧсм-1.
Вміст МДА виражали в мкмоль/л у плазмі крові та мкмоль/кг у печінці.
2.2.3. Метод визначення вмісту гідропероксидів ліпідів (ГПЛ).
Принцип методу грунтується на здатності екстрагованих гептан-ізопропіловою
сумішшю гідропероксидів ліпідів інтенсивно поглинати світло при довжині хвилі
232 нм [314].
До 0,2 мл плазми або 10 % гомогенату печінки додавали 4 мл суміші
гептан-ізопропано