РАЗДЕЛ 2
Материалы и методы исследований.
Для исследования вызванных и спонтанных постсинаптических ответов в нейронах
спинальных ганглиев мы использовали разработанную нами модель – смешанную
культуру диссоциированных клеток спинного мозга и ганглиев задних корешков
спинного мозга.
При проведении экспериментов были использованы следующие методы:
метод фиксации потенциала в конфигурации «регистрация от целой клетки» на
мембране постсинаптической клетки - нейрона спинального ганглия;
метод внеклеточной локальной стимуляции сомы или отростка пресинаптической
клетки - нейрона спинного мозга;
метод быстрой локальной суперфузии участка, занимаемого парой исследуемых
нейронов.
2.1. Покрытие стёкол поли-L-орнитином и ламинином.
Стёкла обрабатывались в течение 24 часа в спирте (96%) и эфире (1:1), затем
промывались дистиллированной водой 6 раз с обеих сторон и стерилизовались в
жарочном шкафу при 180°С в течение 2 часов. Затем стёкла помещали в стерильные
чашки Петри с диаметром дна 35 мм, и на каждое стекло помещалась капля 0,1%
раствора поли-L-орнитина (“SIGMA”, США), объёмом 0,5 мл, растворённого в 150 мМ
боратном буфере (рН=8,35). Стёкла инкубировались в поли-L-орнитине в течение
0,5 часа при комнатной температуре. После этого каждая чашка промывалась в
дистиллированной воде, 3 раза по 2 мл. Покрытые чашки хранились в холодильнике
при +2...5°С в течение 2-3 месяцев.
Покрытые поли-L-орнитином чашки затем покрывались раствором ламинина (“SIGMA”,
США) в концентрации 1мг на 1мл солевого раствора (NaCl – 137 мМ; KCl – 2,7 мМ;
KH2PO4 – 1,47 мМ; NaH2PO4 – 8,06 мМ; HEPES – 15 мМ; глюкоза – 20 мМ). На каждое
стекло капали по 200 мкл раствора ламинина и оставляли на сутки при +2...5°С.
Затем каждую чашку промывали в 2 мл солевого раствора, состав которого описан
выше, и добавляли по 2 мл этого раствора в чашку. Покрытые поли-L-орнитином и
ламинином стёкла хранились в холодильнике при +2...5°С не более трёх недель.
2.2. Объект исследования.
Поскольку мозг млекопитающих организован чрезвычайно сложно, для изучения
некоторых фундаментальных механизмов, лежащих в основе его функций, используют
простые модельные системы.
Культура нервной ткани создаёт исключительные возможности для выявления
элементарных функциональных единиц нервной системы: логических элементов,
преобразователей сигналов, накопителей и интеграторов. Работу нервной системы и
нервных сетей нельзя понять и объяснить только на основе анализа характера
электрической активности нервных клеток. При всякой попытке объяснения работы
нервной системы необходимо учитывать, что нервная система, мозг – это результат
длительной эволюции клетки и клеточных ассоциаций. В результате возникла
устойчивая в течение всей жизни индивидуума система клеток, специфически
организованная для обработки и хранения информации и обладающая рядом
особенностей.
В постнатальном периоде нейроны образуют множество связей с другими клетками.
Основная часть информации, поступающей в нервную систему и выходящей из неё,
закодирована в форме электрических сигналов и лишь небольшая часть – в виде
нейрогуморальных влияний; иных форм, по-видимому, нет. Вся информация,
поступающая в нервную систему, преобразуется, обрабатывается и хранится в
нейронных сетях. Одна из основных форм функциональной активности нейрона и
ассоциаций нейронов – генерация потенциалов действия, синаптических потенциалов
и других форм электрической активности. Другая – активация синтеза РНК, белков
и транспорта веществ между ядром и цитоплазмойпри генерации потенциалов
действия. Синтез РНК, белков и их транспорт разобщены во времени с
электрической активностью. Во время электрической активности происходит
торможение транспорта и синтеза РНК и белков. После её прекращения синтез и
транспорт веществ в клетке резко возрастают. Эти метаболические и структурные
перестройки, которые индуцируются электрической активностью мембраны нейрона,
вероятно, отражают не только процесс обработки сигнала, но и один из
существенных этапов на пути трансформации потенциалов действия и синаптической
активности в устойчивые формы хранения информации.
Представляет исключительный интерес выяснение механизмов развития и созревания
нейронов, их дифференцировки и регенерации и роль в этих процессах спайковой,
синаптической и других видов мембранной активности.
Диссоциированные культуры различных отделов центральной нервной системы
являются удобными экспериментальными моделями и позволяют проводить прямые
манипуляции непосредственно с отдельными нейронами млекопитающих. Однако при
работе с диссоциированными культурами следует учитывать некоторые ограничения.
При дезагрегации тканей клетки подвергаются различного рода воздействиям,
многие из которых могут иметь повреждающие факторы. Сам метод дезагрегации
тканей на отдельные клетки применяется в биологии уже около века, однако и по
сегодняшний день многие исследователи ищут пути наименее травматического пути
получения изолированных клеток.
Межклеточные вещества в разных тканях могут быть различны по своему составу –
от мукополисахаридов до фиброзных белков – и в добавление к углеводным и
белковым элементам содержат неорганические соли. Поэтому различные ткани
требуют различных методов дезагрегации. Эмбриональные ткани и ткани
новорожденных животных со слабо развитым межклеточным веществом очень часто
удаётся дезагрегировать с помощью одной из изложенных ниже методик или их
сочетанием [1]:
Способ механического разделения.
Обработка веществами, связывающими двухвалентные ионы.
Энзиматическое переваривание.
Способ физического разделения отдельно применяется редко, так как этим спос
- Київ+380960830922