Ви є тут

Об'ємрегульовані хлорні канали в клітинах карциноми простати: вплив кальційхелатуючих речовин, рН і протеаз.

Автор: 
Вітко Юлія Михайлівна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2003
Артикул:
0403U000851
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клеточная культура
Клетки линии LNCaP (American Type Culture Collection) культивировали в среде
RPMI 1640 (“Sigma”), обогащённой 5 мМ/л L-глутамина (“Sigma”), 10%
эмбриональной бычьей сыворотки (“Gibco BRL”), 50000 ед/л пеницилина и 50 мг/мл
стрептомицина (“Sigma”). Клетки выращивали во флаконах обьёмом 50 мл при
температуре 37?С в инкубаторе с увлажнённой атмосферой, содержащей 5% СО2. Для
электрофизиологических экспериментов клетки высаживали в чашки Петри, покрытые
полиорнитином (“Sigma”), и использовали на протяжении 4-6 дней.
2.2. Электрофизиологический эксперимент и растворы
Макроскопические мембранные ионные токи в LNCaP клетках (средняя емкость клеток
составляла 25,5±1,2 пФ; n=76) регистрировали с использованием методики
"пэтч-клемп" в конфигурации "целая клетка".
Впервые этот метод был предложен немецкими учеными Е. Неером и Сакманом [132].
Основой метода является регистрация токов, протекающих через небольшой участок
мембраны, электрически изолированный от окружающей среды с помощью стеклянной
микропипетки. Такая изоляция возможна благодаря уникальной способности стекла
образовывать высокоомный контакт (1ё100 ГW) с компонентами клеточной мембраны.
Высокоомный контакт между пипеткой и мембраной в сочетании с высокой
чувствительностью и низким уровнем собственного шума усилителя обеспечивают
возможность регистрации токов в пикоамперном диапазоне, что соответствует токам
через одиночные каналы. Позднее метод был адаптирован для измерения токов всей
мембраны (конфигурация "целая клетка"). Для этого участок мембраны под
микропипеткой прорывают, прикладывая отрицательное давление, и устанавливают
низкоомный контакт с внутриклеточной средой, что позволяет осуществлять
фиксацию потенциала целой клетки. Локальная фиксация потенциала имеет ряд
преимуществ по сравнению с классической двухэлектродной фиксацией, предложенной
в 50-х годах Ходжкиным и Хаксли для исследования ионной проводимости мембраны
гигантского аксона кальмара [81]. Прежде всего в рамках метода "пэтч-клэмп"
фиксация потенциала осуществляется с помощью одной микропипетки, что
значительно облегчает работу с клетками небольшого размера. "Пэтч-клэмп"
позволяет также достигнуть значительно более низкого уровня шумов, обеспечивая,
таким образом, регистрацию и последующий анализ низкоамплитудных токов. Метод
"пэтч-клэмп" в конфигурации "целая клетка" обеспечивает быстрый диализ
внутриклеточной среды.
В наших экспериментах чашка Петри с клетками устанавливали в препаратоводитель,
помещенный на предметном столике инвертированного микроскопа с оптикой (Zeizz,
Германия). Стеклянные микропипетки изготавливались из боросиликатного стекла
(внешний диаметр 1.75 мм). Пипетки имели диаметр кончика 1ё2 мкм и
сопротивление 3ё5 МW при заполнении стандартным "внутриклеточным" раствором.
Пипетку закрепляли в поликарбонатном держателе, прикрепленном к предусилителю
Dagan pc-one, (Dagan Corp., CША). Предусилитель располагался на
микроманипуляторе. Заполненную раствором пипетку опускали во внеклеточный
раствор и компенсировали потенциал кончика, который в среднем составляет 4ё5
мВ. Гигаомные контакты между клеточной мембраной и пипеткой образовывали,
прижимая пипетку с приложенным к ней небольшим положительным давлением к
поверхности клетки и затем сбрасывая это давление до атмосферного. Образование
гигаомного контакта контролировали в режиме фиксации потенциала, подавая на
мембрану прямоугольные гиперполяризующие импульсы амплитудой -10 мВ. После
образования плотного контакта пипетки с поверхностью мембраны производилась
компенсация емкости пипетки относительно внешнего раствора. Конфигурацию "целая
клетка" получали при прорыве мембраны под пипеткой импульсами отрицательного
давления, после чего записывали емкостной ток в ответ на гиперполяризующий
импульс амплитудой в 10 мВ.
Выходящий сигнал усилителя фильтровали при частоте среза 10 кГц с помощью 3-х
полюсного фильтра Бесселя и 2-5 кГц цифровым фильтром. Компьютерная система
обеспечивала также генерацию командных импульсов.
Известно, что в LNCaP клетках присутствует потенциалзависимый
ТЕА-чувствительный калиевый ток [170]. Для того чтобы отделить исследуемый
обьёмактивированный хлорный ток от калиевого, мы использовали ТЕА в качестве
основного катиона для внеклеточных растворов. Осмотичность изо- и
гипотонических растворов составляла 310 и 190 мосмоль/л соответственно. Состав
изо- и гипотонических внеклеточных растворов приведен в таблице 2.1.
Регистрирующую пипетку заполняли внутриклеточным раствором такого состава
(ммоль/л): КОН-100, KCl-40, MgCl2-1, HEPES-10, EGTA-10,
Mg-АТФ –5, рН 7.2 (доводили глутаминовой кислотой). Сопротивление
регистрирующих пипеток колебалось в пределах 3-5 МОм. Трипсин (1 мг/мл, тип II,
(“Sigma”) и соевый ингибитор трипсина (10 мг/мл, тип-II-S, (“Sigma”) добавляли
непосредственно во внутриклеточный раствор,
Таблица 2.1
Состав внеклеточных растворов (ммоль/л)
Состав
раствора
Norm
IsoTEA
HypoTEA
HypoTEA
DVC-free
0/Ca
2/Ca
10/Ca
NaCl
145
-
-
-
-
KCl
5
-
-
-
-
CaCl2
2
0
0
2
10
MgCl2
2
0
2
2
2
Глюкоза
5
10
10
10
10
10
10
HEPES
10
10
10
10
10
10
10
TEA-Сl
-
145
80
80
80
80
64
D-manitol
-
-
-
10
-
2
10
Ca2+-
хелатор
-
-
-
0-40
-
-
-
без существенных изменений осмотичности. Концентрация ка