РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Для выполнения поставленных задач было использовано две основные модели,
позволяющие изучать особенности процессов миелинизации и демиелинизации нервных
отростков, а также фармакологической коррекции измененной миелиновой оболочки.
Первой моделью стала диссоциированная культура клеток мозжечка новорожденных
крыс, при помощи которой были проанализированы этапы миелинобразования и
структурные изменения миелиновых оболочек в процессе экспериментально вызванной
демиелинизации in vitro, а также изучено влияние экстракта гриба H. erinaceus
на структуру миелиновых оболочек и клеток в культуре. Второй, моделью in vivo,
служили здоровые взрослые крысы, у которых была воспроизведена острая форма
ЭАЭ. Данная модель позволила изучить клеточные характеристики нормальной зрелой
ткани ЦНС, а также особенности ультраструктурных изменений в нервной ткани при
демиелинизации, вызванной ЭАЭ.
2.1. Моделирование процесса миелинизации in vitro
Моделью для изучения процесса миелинизации в системе in vitro служила культура
диссоциированных клеток мозжечка новорожденных крыс. Все манипуляции по взятию
материала для культивирования, а также последующие процедуры смены среды и
культивирование проводили в строго стерильных условиях.
Культивирование клеток мозжечка проводилось по описанному ранее методу [152,
206] с рядом модификаций. Новорожденных животных усыпляли эфиром,
стабилизированным для наркоза. Выделенный на холоде мозжечок освобождали от
мозговых оболочек и помещали в питательную среду (температура 40С), которая
содержала 80% минимальной питательной среды DMEM (“Gibco”, США), 10% сыворотки
эмбрионов коровы (“Intergen”, США), 10% лошадиной сыворотки (“Gibco”, CША),
глюкозы (6 г/л) и антибиотиков пенициллин-стрептомицин (200 ед/мл). Затем
мозжечок промывали и механически диссоциировали при помощи трех Пастеровских
пипеток разного диаметра (приблизительно, 0.8, 0.4 и 0.09 - 0.1 мм). После
этого полученную клеточную суспензию переносили на специальный пластик — аклар
Thermanox (NUNC, Дания). Этот пластик относится к группе фторопластов, не
токсичен по отношению к культивируемым клеткам и тканям и легко от них
отрывается после полимеризации эпоксидной смолы, используемой при подготовке
ткани для ЭМ анализа. Аклар предварительно стерилизовали ультрафиолетом и
покрывали 1% водным раствором поли-L-лизина (“Sigma”, США). После этого аклары
помещали в пустые чашки Петри и на каждый из них добавляли 300 мкл клеточной
суспензии. Плотность посадки определялась при помощи камеры Горяева и
составляла 2х105 клеток в 1 мкл. Через 6 часов в чашки Петри добавляли
питательную среду (1.5 мл на чашку Петри). Клетки инкубировали в атмосфере
воздуха, обогащенного СО2 (5%), при температуре 37°С. Питательную среду
заменяли каждые 5 дней; день посадки считался нулевым. Культивирование
продолжалось 21, 26, и 31 день, после чего культивируемые клетки фиксировали и
подготавливали для светооптического и ЭМ анализа.
Прижизненное состояние и развитие культивируемых клеток контролировали при
помощи инвертированного микроскопа с ежедневным фотографированием культуры в
режиме фазового контраста (используемые объективы – х10 и х20, окуляр – 12.5).
Для микросъемки живых неокрашенных культур использовали низкочувствительную
высококонтрастную пленку с высоким разрешением и малой зернистостью изображения
(Микрат-200).
2.2. Метод иммуноцитохимического окрашивания культивируемых клеток
Для детального анализа состояния растущих клеток и происходящих в культуре
процессов, в частности, для выявления интактных ОЛ, был применен метод по
окрашиванию культивируемых клеток антителами к ОБМ. Данный белок
экспрессируется зрелыми дифференцированными ОЛ и локализуется на их
плазматической мембране. Следовательно, он является маркером ОЛ, и окрашивание
культуры антителами к ОБМ позволило выявить живые интактные ОЛ. Моноклональные
антитела к ОБМ крыс (Sigma, США) были любезно предоставлены проф. Х.
Кеттенманном (лаборатория клеточных нейронаук Макс-Дельбрук Центра молекулярной
медицины, Германия). В процессе окрашивания 26-дневные клетки мозжечка
подвергали следующим процедурам:
Промывали трис-забуференным раствором (ТЗР) и фиксировали 4% раствором
формальдегида на 0.1 М фосфатном буфере (ФБ) в течение 1 часа;
Затем инкубировали в 0.05% растворе Тритона Х-100 на ТЗР на протяжении 15 минут
для усиления проницаемости клеточной мембраны при комнатной температуре;
После этого помещали в блокирующий раствор, содержавший ТЗР, 5% раствор
нормальной козлиной сыворотки и 5% раствор бычьего сывороточного альбумина;
Затем окрашивали антителами к ОБМ в течение 12 часов при температуре +40С
(антитела разводились в ТЗР, содержавшем 0.1% раствор бычьего сывороточного
альбумина и 0.1% Tween, в соотношении 1:100);
После 4-5 смен промывания в ТЗР, который содержал 0.1% раствор бычьего
сывороточного альбумина и 0.1% Tween, клетки окрашивали вторичными
биотинилированными антителами (полученные в кролике против крыс, Sigma, США) в
течение 40 минут при комнатной температуре (антитела разводились в ТЗР,
содержавшем 0.1% раствор бычьего сывороточного альбумина и 0.1% Tween, в
соотношении 1:100);
После 4-5 смен промывания, как описано выше, полученный конъюгат метили
комплексом авидин-Alexa-568 в течение 1 часа при температуре 40С (разведение
1:400 в ТЗР, содержавшем 0.1% раствор бычьего сывороточного альбумина и 0.1%
Tween); контрольное окрашивание проводилось по этой же схеме, но без
использования флуорохрома;
Затем окрашенные препараты заключали в среду, содержавшую смесь Мов
- Київ+380960830922