ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕМ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Серии эксперимента и объем исследований
Эксперимент был проведен на 560 крысах-самцах линии Вистар 4-, 5- 6- и 16-недельного возраста. Возраст 4 недели - завершение перехода на самостоятельное питание, а 5-6 недельный - начало периода полового созревания, который завершается у крыс к 9 неделе жизни. Возраст 16 нед. - взрослые крысы.
Экспериментальная часть работы выполнялась в соответствии с Правилами проведения работ с экспериментальными животными, утверждёнными Приказом МЗ СССР N755 от 12.08.1977 г. и этическим кодексом Совета международных медицинских научных обществ по проведению эксперимента с использованием животных [202].
Животные были распределены по экспериментальным группам (Табл.2.1).
Первая серия исследований была направлена на выяснение механизмов активации апоптоза в условиях гипертрофии единственной почки после односторонней нефрэктомии. Изучались процент фрагментации ДНК в ткани почки, содержание свободного сфингозина в почечной ткани, биосинтез оксида азота в ткани почки по содержанию его стабильных метаболитов ( NO2- + NO3- ) и содержание ионов кальция в почечной ткани. Для оценки водного баланса почечной ткани, а также изменения объема клеток проводилась ЯМР-релаксометрия почечной ткани in vitro. Также изучались биосинтез простагландинов Е и F2? из эндогенных предшественников в почечной ткани (коре и медулле) и экскреция ПГЕ и ПГF2? с мочой у животных разного возраста. Кроме того, для оценки функционального состояния почек определялись электролитный состав плазмы и мочи, диурез, осмолярность плазмы и мочи, содержание эндогенного креатинина в плазме и моче.
Таблица 2.1
Распределение животных по экспериментальным группам и объем исследований
Вид исследованияКН/эК+ДН/э + ДВсе-го3 сут7 сут14 сут3 сут7 сут14 сутФрагментация ДНК в ткани почки101010101010101080Содержание свободного сфингозина в ткани почки101010101010101080Содержание стабильных метаболитов оксида азота в ткани почки101010101010101080ЯМР-релаксо-метрия ткани почки101010101010101080Содержание ионов кальция в ткани почек101010101010101080Продолжение табл. 2.1Биосинтез простаноидов в ткани почки40*40*40*40*20202020240Экскреция простаноидов с мочой20*20*20*20*10101010120Концентрация электролитов в сыворотке крови и моче40*40*40*40*20202020240Осмоляльность плазмы и мочи40*40*40*40*20202020240Содержание эндогенного креатинина в плазме и моче40*40*40*40*20202020240К - контрольная группа; Н/э - серия животных с нефрэктомией с подгруппами разных сроков забоя после операции; К + Д - группа контроля с даларгином; Н/э + Д - серия нефрэктомированных животных с введением даларгина с подгруппами разных сроков забоя после операции. * - группы, в которых производились эксперименты с животными разного возраста.
Для изучения динамики изменений в единственной почке в послеоперационный период животные были распределены на подгруппы, которые забивали через 3, 7 и 14 суток после нефрэктомии. На развитие гипертрофии почки в эти сроки после нефрэктомии указано в работах [203, 204].
Вторая серия опытов была направлена на выяснение влияния даларгина (синтетического лей-энкефалина) на активность апоптоза в ткани почки у интактных крыс и после односторонней нефрэктомии, а также на изучение механизма этого влияния. Даларгин (аптечный препарат Dalarginum lyophilisatum 0,001g pro injectionibus, Харьковское предприятие по производству бактерийных препаратов) вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг массы тела в сутки в течение послеоперационного периода, в группе без нефрэктомии даларгин вводился в течение 7 суток. Во второй серии проводились все вышеуказанные в первой серии исследования.
До операции и перед забоем животные регулярно взвешивались. Левостороннюю нефрэктомию производили под гексеналовым наркозом по общепринятому методу в стерильных условиях. Животные забивались декапитацией.
Содержание кальция в ткани почек определяли спектрофотометрически по стандартной методике по реакции с о-крезолфталеинкомплексоном. Измерение проводилось на спектрофотометре СФ-46.
Мочу собирали в течение суток, используя обменные клетки фирмы США, в охлажденный сосуд. Перед контрольным измерением суточного диуреза крысы в целях адаптации к необычным условиям и исключения стрессовой реакции двукратно помещались в обменные клетки для привыкания. При необходимости длительного хранения мочу замораживали и хранили при t = -20 оС.
Кровь собирали в пробирки с гепарином - для определения электролитов, креатинина, осмолярности.
Измерение содержания электролитов в моче, также как и в плазме, производилось с использованием биологического алкали - микроанализатора ОР - 266/1 фирмы Pradelkis (Венгрия).
Содержание эндогенного креатинина определяли фотометрически с помощью спектрофотометра Perkin-Almer (США).
Осмолярность плазмы и мочи измеряли на полумикроосмометре "Knauer" (ФРГ).
На основании определяемых параметров мы получили расчетные величины, характеризующие основные процессы, обеспечивающие функции почек [205]. Об уровне клубочковой фильтрации судили по клиренсу эндогенного креатинина [206]; о способности почки к осмотическому разведению и концентрированию мочи - по концентрационному показателю осмотически активных веществ, количеству осмотически свободной воды, общему объему реабсорбированной воды в канальцах. Ионрегулирующую функцию почек характеризовали по концентрационным показателям натрия и калия, экскретируемым фракциям Na+ и К+, абсолютной и относительной реабсорбции натрия, клиренсу натрия и калия, клиренсу осмотически свободной от натрия воды, показателю эффективной дистальной секреции калия. Систолическое давление измеряли на хвостовой артерии крыс плетизмографическим методом с помощью электросфигмоманоментра фирмы Narco Biosystem (США) до операции и непосредственно перед забоем животных.
Статистич