Глава 2
Объект и методы исследования
Список использованных реактивов
ЭДТА, Тритон Х-100, сахароза, 8-(диэтиламино)октил 3,4,5-триметилбензоат (ТМВ-8) ("Fluka", Щвейцария), натрий уксуснокислый-1-14С (10-50 мКи/ммоль) (ВПО "Изотоп"), [3H]мио-инозит, [14C]олеиновая кислота (58 мКи/ммоль, [14C]арахидоновая кислота (мКи/ммоль), [14C]линолевая кислота (59 мКи/ммоль), [14C]пальмитиновая кислота (60 мКи/ммоль), [3H]мио-инозит-1,4,5-трифосфат, [3H]мио-инозит1,4бифосфат, [3H]мио-инозит-1-фосфат, ("Amersham", Англия), Hepes, трипановый синий ("Serva", Германия), L-тироксин ("Reanal", Венгрия), орцин ("Merk", Германия), форбол 12-миристат 13-ацетат, дитиотрейтол, силикагель ("Woelm", Германия), [U-14C]глюкоза (0,1-1 мКи/ммоль) ("Hemapol", Чехия) и другие реактивы отечественного производства квалификации х.ч.
2.1 Постановка эксперимента
При выполнении настоящей работы использовали самцов крыс линии Вистар 3- и 24-месячного возраста массой 180-250 и 350-450 г, соответственно, содержавшихся в стандартных условиях вивария Харьковского национального университета. Объектом исследования служили изолированные гепатоциты и суспензия ткани печени крыс. Животные были разделены на группы в зависимости от задач эксперимента:
1. Интактные животные, из печени которых выделяли гепатоциты и получали суспензию ткани печени.
2. Животные, которым внутрибрюшинно вводили 1-метил-2-меркаптоимидазол (мерказолил) в дозе 1 мг/100 г массы тела животного в течение 16 дней.
3. Животные, которым на фоне введения 1-метил-2-меркаптоимидазола, за 48 часов до эксперимента вводили L-тироксин в дозе 250 мкг/100 г массы тела.
4. Животные, которым за 48 часов однократно вводили L-тироксин в дозе 200 мкг/100 г массы тела.
5. Животные, которым однократно вводили L-тироксин в дозе 200 мкг/100 г массы тела за 15, 30, 60 и 120 мин до эксперимента.
6. Контрольные животные, которым вводили физиологический раствор (0,9% NaCl) в объеме, соответствующий объему вводимого гормона.
2.2 Определение содержания иодотиронинов
Содержание тироксина и трииодотиронина в сыворотке крови экспериментальных животных определяли с помощию наборов для радиоиммунологического определения РИА-Т3 и РИА-Т4 (ГП "ХОП ИБОХ НАНБ", Беларусь).
2.3 Выделение гепатоцитов
В основе метода выделения гепатоцитов был положен метод Канаевой и соавторов [207, 208]. Перед вскрытием брюшной полости животных наркотизировали диэтиловым эфиром. Печень перфузировали 100 мл 0,9% раствором NaCl , а затем 100 мл инкубационной среды, содержащей 250 мМ сахарозу, 5 мМ KCl, 0,4 мМ Na2HPO4, 0,4 мМ KH2PO4, 0,8 мМ MgCl2, 2 мМ дитиотрейтол, 0,5 мМ ЭДТА, 1% альбумин сыворотки быка (рН 7,4). По окончании перфузии печень извлекали из брюшной полости, помещали в пластиковый стакан, добавляли 20 мл среды и подвергали вибрации с частотой 20 Гц в течение 15 мин на приборе АВ-10П. По окончании, печень продавливали через перфорированную пластинку с диаметром отверстий 0,3 мм, добавляли среду из расчета 40 мл среды на 7 г печени и фильтровали через капроновый фильтр. Полученную суспензию центрифугировали в течение 2 мин при 500 g. Процедуру отмывки гепатоцитов повторяли дважды. Нативность мембран гепатоцитов оценивали по окрашиванию клеток в 0,4% растворе трипанового синего. Выход нативных клеток составлял 90?5%.
2.4 Приготовление суспензии ткани печени
Печень животного, наркотизированного диэтиловым эфиром, перфузировали охлажденным 0,9% раствором NaCl, а затем буфером Кребс-Хенселейт, содержавшим 2 мМ СаСl2 и 0,2% альбумина сыворотки быка. Затем печень извлекали и продавливали через пластину с диаметром пор 0,3 мм.
2.5 Включение изотопной метки в состав эндогенных липидов
Крысам, голодавшим в течение 20 часов и накормленным за 3 часа до инъекции, вводили внутрибрюшинно 0,5 мл раствора ацетата-1-14С натрия (активностью 0,5 или 1,0 мКи) в физиологическом растворе (0,9% NaCl) четырьмя порциями с интервалом в 30 мин согласно схеме, предложенной Кейтсом [209]. Тироксин вводили через 1 час после последнего введения изотопа.
2.6 Эксперименты с суспензией ткани печени
Суспензию ткани печени инкубировали в буфере Кребс-Хенселейт (рН 7,4), содержащем 0,1% альбумин сыворотки быка, 61 мг/л пенициллина, 100 мг/л стрептомицина, а также в отдельных экспериментах [3H]мио-инозит, [14C]олеиновую кислоту, [14C]арахидоновую кислоту, [14C]глюкозу в количестве 1 мКи, 1 мКи, 0,2 мКи и 0,2 мКи, соответственно, в течение определенных интервалов времени. При изучении обмена фосфоинозитидов реакцию останавливали охлажденной смесью метанол:НСl (50:3, по объему), в остальных случаях реакцию останавливали на холоду.
2.7 Эксперименты со свежевыделенными гепатоцитами
Свежевыделенные гепатоциты (концентрация - 107 клеток в 1мл) инкубировали в среде, содержащей 250 мМ сахарозу, 5 мМ KCl, 0,4 мМ KH2PO4, 0,4 мМ Na2HPO4, 0,8 мМ MgSO4, 1,2 мМ CaCl2, 10 мМ Tris-HCl, 61 мг/л пенициллина, 100 мг/л стрептомицина, 1% альбумина сыворотки быка, 2 мМ (1,7 ГБк/ммоль) [14C]пальмитиновой кислоты (рН 7,5) и инкубировали при 37оС в течение 0-60 мин в атмосфере О2 (95%) - СО2 (5%). В отдельных случаях пробы содержали тироксин (10-8 М) или растворитель гормона в соответствующей концентрации, форбол 12-миристат 13-ацетат (1 мкМ) или сфингозин (127 мкМ).
2.8 Включение метки в свежевыделенные гептоциты
Свежевыделенные гепатоциты ресуспендировали в среде, содержащей 250 мМ сахарозы, 5 мМ KCl, 0,4 мМ KH2PO4, 0,4 мМ Na2HPO4, 0,8 мМ MgSO4, 1,2 мМ CaCl2, 10 мМ Tris-HCl, 1% альбумина сыворотки быка, 61 мг/л пенициллин, 100 мг/л стрептомицин (среда А) и 2 мкКи/мл [14C]линолевой кислоты, рН 7,5 и инкубировали при 37оС в течение 15-240 мин. Концентрация клеток в данном случае составляла 107 кл на 1 мл. По окончании инкубации гепатоциты дважды отмывали избытком буфера содержащим 5 мМ KCl, 0,4 мМ K2HPO4, 0,4 мМ Na2HPO4, 0,8 мМ MgSO4, 1,2 мМ CaCl2, pH 7,5, охлажден