Раздел 2
методы исследований
В соответствии с целью работы, направленной на выяснение эффективности
действия УОК и У-4-ХОК на процессы обмена внутриклеточных ферментов и других
соединений подбирали животных, биохимические и другие методы исследований. Для
компьютерных исследований структурных формул УОК и У-4-ХОК использовали
программы «Chembase» и «ОРАКУЛ» [170, 260], с помощью которых выявили перечни
предполагаемых биологических активностей новых веществ.
Цель работы достигалась путем реализации поставленных задач по изучению
действия УОК и У-4-ХОК на процессы обмена внутриклеточных ферментов (активность
АлАТ, АсАТ, ЩФ и КФ), АОС (активность СОД и каталазы, содержание ВГ и
церулоплазмина) медиаторов воспаления (содержание гистамина и серотонина),
липидов (содержание общих липидов и холестерина), ПОЛ (содержание ДК и МДА),
острофазных белков в крови (содержание общего белка, фибриногена,
церулоплазмина). Для экспериментов были использованы белые крысы, как широко
известные экспериментальные животные с необходимым объемом крови [40, 198].
АлАТ (L-аланин: 2-оксоглутарат-аминотрансфераза, КФ 2.6.1.2) катализирует
реакции: б-аминокислота + пировиноградная кислотаDкетокислота + аланин. АсАТ
(L-аспартат: 2-оксоглутарат-аминотрансфераза, КФ 2.6.1.1.) катализирует
реакции: б-аминокислота+б-кетоглутаровая кислота D б-кетокислота+глутаминовая
кислота. Данные реакции обратимые и их константы равновесия близки к единице.
АсАТ имеет два изофермента: митохондриальный и цитоплазматический. АлАТ
размещается только в цитоплазме практически всех клеток организма [113, 114].
При действии стрессовых (воспалительных) факторов на организм возникающий
«синдром цитолиза» сопровождается выходом больших количеств аминотрансфераз из
клеток в плазму крови, в связи с чем в нашей работе активность аминотрансфераз
служила индикатором возможного токсического влияния УОК и У-4-ХОК на процессы
обмена внутриклеточных ферментов. Определяя активность АлАТ и АсАТ в сыворотке
крови, использовали метод, базирующийся на окрашивании гидразонов
пировиноградной и щавелевоуксусной кислот, которые образуются при наличии в
реакционной смеси 2,4-динитрофенилгидразина в щелочной среде с регистрацией
окрашенных химических соединений на «КФК-3» при длине волны л=520–560 нм
[116].
Фосфомоноэстеразы (ЩФ и КФ) обладают способностью гидролизовывать простые эфиры
фосфорной кислоты в щелочной или кислой среде:
ОН
R–О–Р=О +Н2О > R–ОН +Н3РО4
ОН
В клетках кишок, почек, костей, печени, плаценты, крови и др. ЩФ обычно связана
с липопротеидными мембранами, а КФ локализуется в лизосомах. При действии
стрессовых факторов, когда в клетках организма происходит разрушение
липопротеидных мембран и лизосом, наблюдается выход в плазму крови ЩФ и КФ [77,
101]. В нашей работе активность ЩФ и КФ в сыворотке служила индикатором
возможных цитолитических процессов при действии УОК и У-4-ХОК на крыс.
Определяя активность ЩФ в сыворотке крови, использовали метод, базирующийся на
способности фермента в щелочном буферном растворе метилглюкамина расщеплять
4-нитрофенилфосфат до ортофосфата и 4-нитрофенола, которые фотометрировали на
«КФК-3» при длине волны 405 нм [116].
Практически во всех клетках организма локализована СОД, цитозольный изофермент
которой объединяет две субъединицы, содержащие Сu2+ и Zn2+ , а митохондриальный
изофермент содержит ион Mn2+. СОД осуществляет эффективные антиоксидантные
реакции путем обезвреживания супероксидных свободных радикалов, тормозя
развитие цепного окислительного процесса:
У2- + У2- + 2Н+ СОД Н2О2 + О2
При действии стрессовых факторов и усилении ПОЛ происходит активирование и СОД,
а когда резервы защиты истощаются, то преобладание процессов ПОЛ стает
подавляющим [33, 78]. В связи с этим колебания активности СОД в крови в нашей
работе служили показателем, свидетельствующим об интенсивности действия УОК и
У-4-ХОК на супероксиддисмутазное звено АОС. Определяя активность СОД в крови,
применяли метод, принцип которого основан на фотометрической регистрации
скорости ингибирования ферментом аутоокисления адреналина с измерением
экстинций на СФ-46 [73].
Одним из звеньев АОС является функционирование каталазы (оксидоредуктаза, КФ
1.11.1.6, содержит Fe в геме) в пероксисомах клеток по обезвреживанию пероксида
водорода (до 40000 молекул Н2О2 за 1 с), образующегося в том числе в результате
реакций СОД: 2Н2О2 каталаза 2Н2О + ^О2.
При активировании ПОЛ повышается активность и каталазы, а при истощении ее
защитных резервов возникают нарушения метаболизма [78, 113, 114]. В связи с
этим изменения активности каталазы в сыворотке в нашей работе использовались
для суждения об интенсивности действия УОК и У-4-ХОК на каталазное звено АОС.
При определении активности каталазы в сыворотке применяли метод, основанный на
способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий
окрашенный комплекс, фотометрическую регистрацию которого производили на СФ-46
при длине волны л=410 нм [73].
Глутатион – трипептид, г-глутаминилцистеинилглицин в восстановленной форме
(Г–SH) является активным антиоксидантом в клетках :
Два Г-SH обладают способностью превращаться в окисленную форму при отщеплении
двух атомов водорода от сульфгидрильных групп остатков цистеина с появлением
ковалентной связи между атомами серы при катализации глутатионпероксидазой с
восстановлением перекиси водорода: 2 Г–SH + Н2О2 " Г–S–S–Г + 2Н2О
или с восстановлением органического пероксида:
Н Н
2 Г–SH + Н– С – О – ОН " Г–S–S–Г + Н –С – ОН+ Н2О
Н
- Київ+380960830922