РОЗДІЛ 2.
Методологія та методи досліджень.
2.1. Використання моноклональних антитіл для дослідження полімеризації фібрину.
Гібридомна техніка дозволяє одержувати довгоживучі клітини, що здатні
синтезувати та секретувати монАТ, які мають однакову специфічність [147].
Активний центр монАТ (паратоп) взаємодіє із відповідною антигенною
детермінантою (епітоп). У білкових молекулах епітоп звичайно утворений 5-7
амінокислотними залишками, які розташовані послідовно чи знаходяться у різних
ділянках одного чи декількох поліпептидних ланцюгів, але просторово зближені за
рахунок вторинної та третинної структур [148]. Завдяки своїй унікальній
специфічності монАТ часто використовують як молекулярні зонди для виявлення та
локалізації функціонально важливих ділянок у білкових молекулах.
На сьогоднішній день вже одержано багато монАТ до різних ділянок молекул
фібриногену та фібрину людини. Деякі з цих монАТ здатні порушувати процес
полімеризації фібрину. Таке порушення (інгібування) відбувається частіше всього
внаслідок взаємодії монАТ з епітопом в молекулі фібрину, який знаходиться
безпосередньо чи поруч із певним центром полімеризації чи сайтом зв’язування
тромбіну [149-153]. Інгібування полімеризації може відбуватися також через
стеричні перешкоди, які викликають монАТ приєднані до молекул фібрину. Але такі
монАТ одержують значно рідше, і однією з їх властивостей є те, що самі монАТ
(Мr = 150000) інгібують полімеризацію фібрину, а їх Fаb-фрагменти (Мr = 50000)
ні [154]. За допомогою монАТ були виявлені ділянки молекули фібрину, які можуть
відповідати невідомим ще центрам полімеризації. Так монАТ, епітоп для яких
знаходиться у Вв 43-47 виявились сильними інгібіторами полімеризації фібрину
[150]. Fаb- фрагменти цих антитіл інгібували полімеризацію на 50% при їх
молярному співвідношенню до фібрину 1,5 до 1. Інші три монАТ епітопи для яких
знаходяться у ділянках Аб 240-268, Аб 425-440 та Аб 541-574 інгібували
полімеризацію на 50% при молярному співвідношенні будь-якого з них до фібрину
0,1 до 1 [151]. Автори цієї роботи вважають, що інгібування полімеризації при
такому співвідношенню монАТ до фібрину свідчить про порушення тільки стадії
латеральної асоціації протофібрил.
2.2. Виявлення нових центрів полімеризації за допомогою дослідження
інгібіторних властивостей фрагментів молекули фібрин(оген)у.
Полімеризація фібрину здійснюється за рахунок міжмолекулярної взаємодії
комплементарних центрів, що утворені певними амінокислотними залишками. Тому
порушення таких взаємодій призводить до інгібування полімеризаційного процесу.
Порушення взаємодії між центрами полімеризації може виникати за рахунок різних
чинників, таких як зміна умов середовища (іонна сила, рН, температура, тощо), а
також присутність фрагментів фібрин(оген)у (чи навіть синтетичних пептидів),
які містять в собі функціонально активні центри полімеризації. Дані фрагменти
конкурують з молекулами фібрину за зв’язування з відповідними центрами,
внаслідок чого процес полімеризації інгібується. Тому наявність інгібіторних
властивостей у фрагментах фібрин(оген)у може слугувати доказом того, що даний
фрагмент містить певний центр (чи центри) полімеризації фібрину. Так, саме
дослідження інгібіторних властивостей різних пептидів, які відповідають NH2-
кінцевій частині a- ланцюга фібрину дозволили одержати один з найбільш вагомих
доказів того, що центр "A" утворений а.з. Аб Gly17, Рro18, Arg19 [5].
Синтетичний пептид Gly-Рro-Arg-Рro зменшував швидкість полімеризацію на 50% при
його молярному співвідношенні до фібрину 190 [155]. Також була показана
інгібіторна активність і для фрагментів з NH2- кінцевої частини b- ланцюга
фібрину. Фрагменти Вb15-18, Вb15-26 та Вb15-42 зменшували швидкість
полімеризацію на 50% при їх молярному співвідношенні до фібрину 500, 430 та 50
відповідно [155]. На порядок більша інгібіторна активність фрагменту Вb15-42
порівняно із фрагментом Вb15-18, який відповідає відомому центру "В", дозволила
авторам цієї роботи зробити припущення про існування у ділянці Вb19-42
невідомого ще центру полімеризації [155].
Інгібіторні властивості фрагментів фібрин(оген)у досліджують за допомогою
різних методів. Найбільш простими методами є вимірювання світлорозсіювання
розчинів де відбувалася полімеризація фібрину у відсутності та у присутності
інгібіторів через певний проміжок часу, чи вимірювання світлорозсіювання таких
розчинів тільки після центрифугування і видалення згустків [156, 157]. Більш
ефективним і інформативним методом є турбідиметричний аналіз, який дозволяє
проводити вимірювання світлорозсіювання розчинів, де відбувається полімеризація
фібрину у динаміці [158]. При цьому можна визначити ряд важливих параметрів
(лаг-період, tga, Dh), які характеризують різні стадії процесу полімеризації
фібрину.
2.3. Визначення концентрації білків.
Концентрації білків визначали за різницею значень оптичної густини відповідних
розчинів при довжині хвилі 280 нм та 320 нм. Питомий коефіцієнт екстинції
(Е280,1%,1см) для фібриногену дорівнював 15,06; для фібрину desAABB – 14,84;
для D-димеру та D-фрагменту – 20,0; для b-ланцюга D-димеру – 22,9; для
g-ланцюга D-димеру – 22,1; для плазміногену – 16,1; для монАТ – 14,0; для Fаb-
фрагментів монАТ – 15,6. Визначення оптичної густини розчинів проводили на
спектрофотометрі СФ-26 ("ЛОМО", СРСР).
2.4. Електрофорез у ПААГ.
Аналітичний електрофорез білкових препаратів денатурованих за допомогою ДС-Na
проводили за раніш описаним методом [159]. Використовували наступні буферні
розчини:
Анодний буфер : 0,2М трис-НСl, рН 8,9.
Катодний буфер : 0,1М трис; 0,1М трисин; рН 8,25.
Буфер для концентруючого гелю: 0,71
- Київ+380960830922