ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
В работе использовали следующие штаммы E. coli (табл. 2.1.)
Таблица 2.1.
Штаммы E. coli, использованные в работе
ШтаммГенотипПроисхождениеXL1-BlueF,:: Tn10 proA+B+ laclq ?(lacZ)M15/recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) thi hsdR17 (r-k m+k) supE44 relA1 lacStratagene, СШАTOP 10F- mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) ??????????? ?lacX74 deoR recA1 araD139 ?(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Strr) endA1 nupGInvitrogen, СШАBL21(DE3)
pLysSF- ompT hsdSb(r-bm-b) gal dcm (DE3) pLysSNovagene, СШАAD8571F- araD139 ?(argF-lac) U169 rpsL150 relA flbB5301 ptsF25 deoCI ??ompR-greB??greA::KanrОрлова М. и сотр., 1995CAG 3016на основе MG 1655
rpoB114(sck6)cps F4::Tn10, Rifr, Tcr Предоставлен проф.
К. СевериновымJM 105thi rpsL (Strr) endA sbcB15 hsdR4 supE ??lac-proAB) F, [traD36 proAB+ lacIq lac?????]Amersham Pharmacia Biotech, США
В работе использовали штамм T. thermophilus HB8, предоставленный коллегами из сотрудничающей лаборатории, RIKEN Harima Institute, Япония.
В работе использовали следующие плазмиды (табл. 2.2).
Таблица 2.2.
Плазмиды, использованные в работе
ПлазмидаОписаниеИсточникpTRC99AЭкспрессирующий вектор, под контролем trc промотораPharmacia, СШАpET19bЭкспрессирующий вектор, под контролем промотора фага Т7Novagene, СШАpCYB2b` C-PKAЭкспрессирует ген rpoC с сайтом для PKA и 6x His на С-конце. Под контролем tac промотораПредоставлен проф.
К. СевериновымpMO1.1hisgreA, несущий 6 His на С-конце, в pTRC99AКулиш Д. и сотр., 1997 pMO1.4hisgreВ, несущий 6 His на С-конце, в pTRC99AКулиш Д. и сотр., 1997pDKA143MgreA T143M, несущий 6 His на С-конце, в pTRC99A (спонтанная мутация)Кулиш Д. и сотр., 1997
pET68greВ, несущий 6хHis и PKA-сайт на N-конце, C68SЛомакин И. и сотр., 1997
Все плазмиды несут маркер устойчивости к ампициллину и IPTG-индуцируемые промоторы.
В работе получены следующие плазмиды, экспрессирующие соответствующие гены (табл. 2.3).
Таблица 2.3.
Плазмиды и кодируемые гены, использованные в работе
ПлазмидаВекторКодируемый генpETgreA1pET19bT.thermophilus greA1pETgreA1-NHpET19bто же, с 6х His на N-концеpETgreA1-NPHpET19bто же, с 6х His и PKA-сайтом на N-концеpETgreA1 C88S-NHpET19bT.thermophilus greA1, точечная мутация C88SpETgreA1 C88S L38C-NHpET19bT.thermophilus greA1, двойная мутация C88S, L38CpETgreA1 C88S R53C-NHpET19bT.thermophilus greA1, двойная мутация C88S, R53CpETgreA1 C88S R54C-NHpET19bT.thermophilus greA1, двойная мутация C88S, R54CpETNA1/CA2-NHpET19bгибрид: N-домен T.thermophilus greA1, С-домен T.thermophilus greA2pETgreA2-NHpET19bT.thermophilus greA2 с 6х His на N-концеpETgreA2-NPHpET19bто же, с 6х His и PKA-сайтом на N-концеpETNA2/CA1-NHpET19bгибрид: N-домен T.thermophilus greA2, С-домен T.thermophilus greA1pETNA2-NHpET19bN-домен T.thermophilus greA2 с 6х His на N-концеПродолжение таблицы 2.3pETCA2-NHpET19bС-домен T.thermophilus greA2 с 6х His на N-концеpET68greB 38pET19bE. coli greB S38G с сайтом для PKA и 6x His на N-концеpET68greB 40pET19bE. coli greB G40F с сайтом для PKA и 6x His на N-концеpET68greB 43pET19bE. coli greB S43F с сайтом для PKA и 6x His на N-концеpET68greB 70pET19bE. coli greB E70A с сайтом для PKA и 6x His на N-концеpTRC99A rpoC -NPHpTRC99AE. coli rpoC с сайтом для PKA и 6x His на N-концеpETsigApET19bT.thermophilus sigApETsigA-NH pET19bT.thermophilus sigA с 6х His на N-конце
2.2. Питательные среды и антибиотики
Жидкой питательной средой во всех случаях служил LB-бульон (Fisher Scientific, США). Твердые питательные среды получали добавлением в LB агара до 1,5% [119].
В работе использовали следующие концентрации антибиотиков:
- ампициллина 100-150 мкг/мл (USB, США)
- хлорамфеникола 30 мкг/мл (Fisher Scientific, США)
- тетрациклина 25 мкг/мл (Fisher Scientific, США)
- рифампицина 20-50 мкг/мл (ICN, США)
2.3. Молекулярное клонирование
2.3.1. Компетентные клетки и трансформация бактерий
Компетентные клетки E. coli готовили по методикам описанным в практическом руководстве по молекулярному клонированию [119]. Кратко: 200 мл клеток, находящихся в логарифмической фазе роста (А600~0.4-0.5) осаждали низкоскоростным центрифугированием (2500 g) на центрифуге Sorvall RC-5B (Du Pont Instruments, США) при температуре +4оС в течение 10 мин. Клетки промывали на холоду 4 раза 3-4-кратным объемом 10% стерильного холодного (+4оС) раствора глицерина. После промывания клетки ресуспендировали в 1-1.5 мл того же раствора, разделяли на аликвоты по 30 мкл и замораживали при -80оС. К одной аликвоте на льду добавляли 10-50 нг плазмидной ДНК и помещали смесь в кювету для электропорации (Bio-Rad, США). Процедуру электропорации проводили на приборе Electroporator 2510 (Eppendorf, США) согласно прилагаемому руководству.
В некоторых случаях для приготовления компетентных клеток для трансформации неэлектропорационным методом использовали коммерческий набор "Z-Competent"( Zymo Research, США), обеспечивающий полный набор буферов для приготовления стока компетентных клеток E. coli.
2.3.2. Выделение геномной ДНК
Геномную ДНК (гДНК) из T. thermophilus и E. coli CAG 3016 выделяли следующим образом: 250 мг клеток T. thermophilus или E. coli, хранившихся при -80оС, суспендировали в 567 мкл TE буфера (10 мМ Трис-Cl, pH~7.5; 1 мМ ЭДТА, pH~7.5). К суспензии добавляли 30 мкл 10% ДСН и протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл, смесь перемешивали и инкубировали в течение 1 часа при 37оС. К содержащему лизир