ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Содержание и объём экспериментальных исследований
Биохимические исследования проведены на сетчатке 36 половозрелых кроликов породы Шиншилла, весом 2-2,5 кг, обоего пола, с равномерно пигментированным глазным дном, находящихся в одинаковых условиях содержания. Эксперименты проводились в осенне-зимний период.
Содержание и объем экспериментальных исследований представлены в таблице 2.1. Состояние мембран лизосом сетчатки оценивали опосредованно по изменению неседиментируемой и общей активности маркерного фермента лизосом - кислой фосфатазы.
Таблица 2.1
Содержание и объем экспериментальных исследований
№ п/п Название экспериментаКоличество глаз опытконтроль1. Определение стабильности лизосомальных мембран сетчатки при воздействии НИИ ПП лазера инфракрасного диапазона спектра различных энергетических характеристик (?=890 нм)
12
122. Определение стабильности лизосомальных мембран сетчатки при воздействии НИИ ПП лазера красного диапазона спектра различных энергетических характеристик (?=650 нм)
12
123. Определение стабильности лизосомальных мембран сетчатки при воздействии He-Ne лазера различных энергетических характеристик (?=633 нм)
12
12
ВСЕГО
3636 2.2. Используемая аппаратура и методика облучения экспериментальных животных
Облучение сетчатки глаз кроликов проводили в условиях in vivo ПП лазером ближнего ИК-диапазона (?=890 нм, W=0,4-2,5 мВт), красного диапазона спектра (?=650 нм, W=0,4-2,8 мВт) и He-Ne лазером (?=633 нм, W=0,4-2,8 мВт), работающих в непрерывном режиме с экспозицией (t) 300 с, ежедневно в течение 10 дней. Правый глаз облучался, левый глаз, закрываемый пластинкой, был контрольным.
Основными нормируемыми параметрами при облучении были: энергетическая освещенность (E) и время экспозиции, которые изменялись в зависимости от поставленных задач.
Энергетическая освещенность устанавливалась путем изменения значения выходной мощности с помощью регулятора мощности, в качестве которого использовали набор нейтральных фильтров, или путем изменения диаметра лазерного пучка, рассчитывалась по формуле:
E=W/S, где
E - энергетическая освещенность в мВт/см?;
W - мощность лазерного излучения в плоскости объекта в мВт;
S - площадь пятна лазерного пучка в плоскости облучаемого объекта в см?.
Схема облучения сетчатки глаз кролика различными видами НИЛИ (?=890, ?=650 и ?=633 нм) в экспериментальных условиях представлена на рисунке 2.1. Направляя лазерный луч (5) на глаз кролика (1), он проходил через плоскопараллельную пластину (3) для индикации выходной мощности ЛИ, попадал на линзу (2), регулирующую размер пятна в плоскости роговицы и фокусировался на сетчатку. Контроль мощности ЛИ в процессе облучения экспериментального материала производили с помощью фотоэлектрического индикатора мощности (4), который калибровался перед каждым экспериментом с помощью стандартного измерителя ИМО-2Н.
Рис. 2.1. Схема воздействия лазерного излучения на сетчатку глаза кролика:
1 - сетчатка глаза кролика; 2 - линза; 3 - плоскопараллельная пластинка; 4 -фотоэлектрический индикатор мощности; 5 - источник лазерного излучения.
Используемые энергетические параметры лазерного излучения в эксперименте представлены в таблице 2.2.
Таблица 2.2
Энергетические параметры лазерного излучения в эксперименте
№ п/пОбъект исследованияТип лазераЭнергетичес-кая освещен-ность,мВт/см?Экспо-зиция, с1.Определение стабильно-сти лизосомальных мембран сетчатки при воздействии НИЛИПП лазер инфра-красного диапа-зона спектра (?=890 нм)0,43001,03001,43002,53002.Определение стабильно-сти лизосомальных мембран сетчатки при воздействии НИЛИПП лазер красно-го диапазона спе-ктра (?=650 нм)0,43001,03001,43002,83003.Определение стабильно-сти лизосомальных мембран сетчатки при воздействии НИЛИHe-Ne лазер (?=633 нм)
0,43001,03001,43002,8300
2.3. Подготовка материала к биохимическим исследованиям
По окончании лазерного воздействия животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии. Глаза кроликов энуклеировали и промывали охлажденным раствором сахарозы 0,25 М с 0,001 М ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты динатриевая соль) рН 7,4.
Все последующие операции - выделение сетчатой оболочки и приготовление ее гомогената проводили при общем и локальном охлаждении, учитывая факт ранних посмертных изменений в структуре сетчатки [231].
После удаления тканей переднего сегмента глаза (роговицы, радужки, цилиарного тела, хрусталика, стекловидного тела) глазной бокал промывали раствором сахарозы, указанной выше концентрации, собирали отслоившуюся сетчатку и осторожно отделяли ее от сосудистой оболочки в месте прикрепления - в области ora serrata.
Готовили 10% (масса/объем) гомогенат сетчатки, используя стеклянный гомогенизатор Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком (зазор 0,16-0,24 мм), который приводился в движение электромотором, что позволяло контролировать скорость вращения пестика. Скорость поступательного движения стакана контролировали по секундомеру. Условия гомогенизации: 90 с, скорость вращения 1200 об/мин. Биохимические исследования проводили в надосадочной жидкости после центрифугирования цельного гомогената при 1100 g 5 мин на рефрижераторной центрифуге К-24 (К. Цейсс Йена).
Состояние мембран лизосом оценивали опосредованно по изменению неседиментируемой и общей активности маркерного фермента лизосом - кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2.), основываясь на общепринятых положениях о том, что увеличение или уменьшение неседиментируемой, а также отношения неседиментируемой активности кислой фосфатазы к общей является объективным показателем изменения стабильности мембран этих внутриклеточных органелл [131].
Неседиментируемую активность кислой фосфатазы определяли в надосадочной жидкости после центрифугирования гомо