РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Методы заготовки и режимы криоконсервирования сыворотки кордовой крови
Для получения полноценной криоконсервированной СКК, как и любого другого биологического объекта, принципиальное значение имеет ее исходное состояние, т.е. особую значимость приобретает разработка рациональных методов заготовки СКК. Этап получения материала от донора, являясь начальным, очень важен для заготовки качественного образца с точки зрения его объема и отсутствия микробного обсеменения.
Все существующие методики сбора КК условно подразделяются на две группы: методы сбора в "открытой" и "закрытой" системах [219].
Задачу получения стерильной полноценной КК мы решали, используя способ заготовки, который предусматривает замкнутую систему. Мы отдали предпочтение "закрытой" методике сбора КК, руководствуясь данными литературы, свидетельствующими о том, что использование методов сбора в "закрытой" системе значительно снижает риск микробной контаминации и получения примеси материнской крови [164, 219].
Кровь заготавливали в асептических условиях при физиологических родах у соматически здоровых женщин с неосложненным течением беременности, обследованных перед родами по схеме доноров крови. Осуществляя забор крови, обрабатывали руки, как для операции, надевали стерильный халат и стерильные одноразовые резиновые перчатки. Сразу после рождения ребенка от матери с Rh-отрицательным типом крови или после прекращения пульсации сосудов пуповины в случае Rh-положительного типа крови у роженицы и до появления признаков отделения плаценты пуповину пережимали зажимом Кохера, но не рассекали. Пуповину над зажимом на протяжении 4-5 см обрабатывали с помощью стерильных ватных тампонов дважды 70% спиртом и дважды 2% спиртовой настойкой йода. Используя стандартную стерильную одноразовую систему для забора крови, пунктировали пупочную вену толстой иглой и набирали кровь самотеком в завальцованные стерильные сухие стеклянные флаконы емкостью 100 мл с резиновой крышкой. Осуществляя забор крови, избегали прикосновений руками к роженице, новорожденному, пупочному канатику, манипулируя с последним через стерильную пеленку, чтобы снизить риск инфицирования материала. Таким образом получали кровь, которая оставалась в сосудах последа (плаценты и пуповины) после рождения ребенка и отделения его от матери. Объем ее составлял в среднем 100-150 мл при первых родах и 50-100 мл - при повторных [47, 115].
Флакон с полученной КК маркировали. После рождения последа отделяли часть плаценты (до 5 г), размещали в отдельном флаконе, герметизировали, маркировали. Из кубитальной вены матери забирали 10 мл крови в пробирку, герметизировали, маркировали. Заполняли соответствующую документацию (паспорт биологического материала, обратный талон к паспорту биологического материала, журнал регистрации кордовой крови) [47].
Герметизированные флаконы с КК транспортировали в криобанк специальной машиной в холдерах, которые предохраняют от негативных механических повреждений. При транспортировке придерживались относительно постоянной температуры, которая обеспечивалась изотермической тарой. Время транспортировки не превышало 2 часов [47].
КК после заготовки выдерживали 6-8 часов при температуре +16°С ... +20°С, затем помещали в бытовой холодильник и сохраняли при температуре +4°С 18-20 часов [47].
По данным литературы, более длительное хранение крови при положительных температурах увеличивает риск развития инфекции, приводит к изменению рН и понижению устойчивости белков, о чем свидетельствуют изменения соотношений белковых фракций (уменьшение ?- и ?-глобулинов, возрастание ??- и ??-глобулинов), а также увеличение электрофоретической подвижности протеинов и уменьшение коэффициента термической дегидратации [51, 70].
Центрифугировали КК в стеклянных флаконах при 2000-3000 об/мин в течение 30 мин при температуре +4°С, затем в асептических условиях (в условиях стерильного бокса и ламинара) отделяли СКК, переносили ее в стерильный стеклянный флакон. Полученную СКК разливали с помощью стерильного шприца одноразового применения по 1 мл в стерильные одноразовые полиэтиленовые контейнеры емкостью 1,0 мл [47, 70, 96].
СКК, предназначенная для клинического применения, подвергалась бактериологическому и вирусологическому контролю. Для этого брали образец из каждой партии СКК для бактериологического исследования, которое проводили согласно инструкции контроля консервированной крови, ее компонентов, препаратов, консервированного костного мозга в бактериологической лаборатории станции переливания крови. При отсутствии бактериального загрязнения образца партия считалась стерильной. С целью исключения пренатальных инфекций обязательно обследовали СКК согласно требованиям тканевых банков: определяли наличие или отсутствие антител против вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), гепатита C, краснухи, сифилиса (кардиолипинового антигена) и HBs-антигена вируса гепатита B с помощью иммуноферментных систем фирм "Диаплюс" и "Abbot" (Германия); выявление геномной ДНК вируса герпеса, цитомегаловируса и хламидий проводили с использованием метода полимеразной цепной реакции (PCR). Объектами исследования служили сыворотка крови роженицы, СКК и фрагмент ткани плаценты [47].
Такая схема аттестации материала соответствует принятым международным стандартам оценки на инфицированность используемых для клинических целей биологических объектов [90, 97, 124, 195].
После получения результатов вышеперечисленных исследований, свидетельствующих об отсутствии инфицированности биоматериала, данная партия СКК допускалась к использованию в клинике.
С целью разработки оптимальных технологий низкотемпературного консервирования СКК, позволяющих максимально сохранить ее состав и свойства, мы применяли в своих исследованиях классические программы замораживания для биологических жидкостей (быстрое и медленное замораживание). Наиболее часто, по данным литературы
- Київ+380960830922