РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження
Таблиця 2.1
Кількісний розподіл матеріалу за строками онтогенетичного розвитку курки
Термін
інкубаціїСтадія розвиткуКількість об'єктів48 годин121056 годин151564 години171578 годин19155,5 діб28157,5 діб321014 діб401016 діб421018 діб441021 доба4610Усього120 Матеріалом для даного дослідження послужили серця ембріонів курей, яких отримували згідно загальноприйнятим методикам інкубації [168]. Ембріональний матеріал експериментальних тварин одержували в лабораторних умовах відповідно до рекомендацій, викладених в довідково-методичному посібнику "Объекты биологии развития" [168], при використанні відповідних таблиць нормального розвитку ембріона курки за Гамбургером і Гамільтоном. Усього було досліджено 120 об'єктів. Розподіл матеріалу за стадіями та термінами інкубації представлений в таблиці 2.1.
2.2. Методи дослідження
2.2.1. Морфологічні методики:
* Інкубація. Метою інкубації було отримання курячих ембріонів з фіксованими термінами розвитку. Інкубацію проводили в лабораторних умовах за загальноприйнятими методиками. Вибірка і стандартизація термінів розвитку ембріонів здійснювалася за допомогою стандартних таблиць нормального розвитку Гамбургера і Гамільтона.
* Препарування. Метою цієї методики було одержання ембріонів на ранніх стадіях розвитку й ізольованих сердець ембріонів курки на більш пізніх термінах інкубації. Ембріони з терміном інкубації до 6 доби фіксувалися цілком, а усі більш пізні терміни розвитку ембріонів підлягали препаруванню, тобто серця ембріонів вилучалися і фіксувалися окремо.
* Виготовлення гісто-топографічних зрізів, світлова мікроскопія (фарбування залізним гематоксиліном Гейденгайна, фарбування на виявлення сполучнотканинних елементів). Метою даної методики стало уточнення просторової орієнтації і співвідношення структур клапанного апарату, що формується з стінками серця та самого серця з іншими органами грудної клітини. Дана методика застосовувалася нами тільки на ранніх стадіях розвитку ембріона (до 6 доби інкубації).
2.2.2. Гістологічні методики
Виготовлення серійних гістологічних зрізів, світлова мікроскопія (фарбування залізним гематоксиліном Гейденгайна, фарбування на виявлення сполучнотканинних елементів, фарбування за методом Маллорі-Слінченко). Метою даної методики було виявлення на ранніх стадіях розвитку елементів кардіогелю і на більш пізніх стадіях - виявлення колагенових волокон у клапанах серця, що формуються, (фарбування за Маллорі-Слінченко). Підготовка препаратів для морфометричного аналізу включала фарбування отриманих напівтонких зрізів з використанням залізного гематоксиліну Гейденгайна. Для цього зрізи заздалегідь обробляли 2,5%-ним розчином залізо-аміачних квасків протягом 6 хвилин при температурі +60°С і забарвлювали розчином Гейденгайна (0,5 г гематоксиліну в 10 мл етанолу і 90 мл дистильованої води) протягом 4 хвилин при температурі +70°C. Після промивки і висушування забарвлені зрізи брали в бальзам. На пізніших стадіях розвитку використовували забарвлення за Маллорі-Слінченко, для виявлення сполучної тканини, а саме елементів колагенових та еластичних волокон фіброзного кільця та клапанів серця.
* Виготовлення напівтонких зрізів, світлова мікроскопія (фарбування залізним гематоксиліном Гейденгайна, фарбування на виявлення сполучнотканинних елементів, фарбування за методом Маллорі-Слінченко). Метою даної методики було виявлення стадій утворення та редукції кардіогелю, дослідження мезенхімних клітин ендокардіальних подушок, а саме їх форми, щільності та утворення перших сполучнотканинних елементів.
При дослідженні формування елементів передсердно-шлуночкових клапанів та компонентів папілярно-трабекулярного апарату серця птахів були обрані саме ці методики. Методика виготовлення гісто-топографічних зрізів використовувалась нами тільки на самих ранніх стадіях розвитку (до 6-ї доби інкубації). Вилучені ембріони фіксували рідиною Буена та заливали у парафін за загальноприйнятими методиками. Гістологічні та гісто-топографічні зрізи робилися завтовшки від 7 мкм до 15 мкм на ротаційному мікротомі. Гісто-топографічні зрізи демонстрували не тільки будову серцевих компонентів, а й також топографію великих судин, що виходять з серця та давали уяву про взаємне співвідношення органів грудної клітки. Фарбування проводили за різними методиками. На ранніх стадіях розвитку фарбували зрізи залізним гематоксиліном Гейденгайна, а на більш пізніх проводили фарбування на знаходження сполучної тканини за Маллорі-Слінченко та шик-реакцію.
Для вивчення тонких структур (ендокардіальної вистилки, епітеліально-мезенхімних перетворень, кардіогелю) готували напівтонкі зрізи завтовшки 1-2 мкм (епон-аралдіт; ловікрил) і використовували для стереологічного аналізу. Для виготовлення напівтонких зрізів фрагментів серця ембріону курки шматочки тканини об'ємом близько 1 мм3 фіксували в 2,5 % розчині глютаральдегіда, виготовленому на 0,1 М фосфатному буфері (pH 7,4) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Дофіксацію проводили 1% розчином чотирьохокису осмію на тому ж буфері протягом 2-х годин. Після зневоднення шматочки тканини заключали у суміш епону й аралдіту відповідно до рекомендацій [169, 170].
2.2.3. Морфометрія, статистичний аналіз
У рамках морфології системне дослідження характеризується двома основними вимогами: кількісним описом властивостей структурно-функціональних елементів об'єкта і визначенням тісноти зв'язку між ними [171, 172]. При цьому першу частину системного дослідження виконують за допомогою методів кількісної морфології. При проведенні морфологічного дослідження серця, що розвивається, керувалися загальними принципами стереометричного аналізу, викладеними Г.Г.Автанділовим [171, 173], Г.С.Кір'якуловим з співавт. [174]. Враховуючи специфіку поставлених задач, в даному дослідженні була проведена кількісна оцінка наступних показників:
- питома площа пере