Вы здесь

Механізми взаємодії FMRFa-подібних пептидів з протон-активованими каналами в сенсорних нейронах щурів

Автор: 
Островська Ольга Ігорівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2003
Артикул:
0403U004266
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РАЗДЕЛ 2
Материалы и методы исследований
2.1. Экспериментальные животные
Исследования проводились на изолированных нейронах спинальных
(заднекорешковых) ганглиев и тригеминальных ганглиев крыс линии Вистар возраста
5-10 дней. Крысы выращивались в стандартных условиях в виварии института
физиологии им. Богомольца А. А. и содержались на сбалансированной диете. Выбор
возраста обуславливался двумя критериями:
а) возможность быстрого и качественного выделения ганглиев животного и затем
изолированных клеток путем ферментативной обработки;
б) наибольшая степень выживаемости нервных клеток в условиях первичной
культуры.
Пол животных в данной работе значения не имел.
2.2. Общие свойства сенсорных нейронов заднекорешковых ганглиев и тройничного
нерва
Первичные сенсорные нейроны позвоночных представляют собой псевдоуниполярные
клетки, которые находятся в спинальных заднекорешковых ганглиях или в узлах
черепно-мозговых нервов. В зарубежной литературе эти клетки получили название
DRG или trigeminal соответственно, нейронов.
Отростки нейронов спинальных ганглиев осуществляют рецепцию внутренних и
внешних раздражителей и передачу возбуждения к вторичным сенсорным нейронам
центральной нервной системы, находящимся в задних рогах спинного мозга или в
ядрах Голя и Бурдаха продолговатого мозга. В зависимости от размера сомы
нейроны спинальных ганглиев делят на большие (диаметр сомы 45-60 мкм), малые
(диаметр сомы 10-30 мкм), а так же средние нейроны с диаметром сомы 33-38 мкм,
выделяемые некоторыми авторами, как отдельная группа [102]. Существует
корреляция между размерами сомы нейронов спинальных ганглиев и скоростью
проведения потенциала действия по их аксонам. Нейроны спинальных ганглиев делят
на быстропроводящие (большие по диаметру) нейроны со скоростью проведения более
14 м/с, медленнопроводящие (малые по диаметру) нейроны со скоростью проведения
менее 8 м/с. В зависимости от типа аксона нейроны делят на А-клетки
(быстропроводящие большого диаметра) и С-клетки (медленнопроводящие малого
диаметра) Считают, что со скоростью проведения потенциала действия по аксону
тесно связана модальность нейронов спинальных ганглиев: быстропроводящие Аб- и
Ав-волокна, идущие от кожи и мышц, передают в основном тактильную и
проприоцептивную информацию, тогда как медленнопроводящие Ад- и С- волокна
обеспечивают болевую и сенсорную чувствительность. Таким образом, спинальные
заднекорешковые ганглии теплокровных состоят как минимум из двух групп клеток,
обеспечивающих ноцицептивную и термомеханорецепторную чувствительность.
Идентифицировать первичные сенсорные нейроны как неноцицептивные А-клетки и
ноцицептивные С-клетки можно по размерам сомы сенсорных нейронов.
Голова иннервируется 12 парами черепно-мозговых нервов, большинство которых
присоединяется к центральной нервной системе в стволе мозга и промежуточном
мозгу. Пятый из этих нервов, называемый тройничным из-за своих трех ветвей,
включает афференты от лица и ротовой полости. Он иннервирует кожу, зубы,
слизистую рта, язык и роговицу. Афференты тройничного нерва образуют синапсы в
ядре спинального тракта и главном сенсорном ядре. Здесь механорецептивная,
терморецептивная и ноцицептивная информация передается на аксоны, несущие ее к
ретикулярной формации и таламусу. В стволе мозга информация, приносимая
тройничными афферентами, интегрируется в двигательные рефлексы мускулатуры
головы и во множество вегетативных рефлексов. Тройничная система осуществляет
жизненно важные функции тактильного исследования окружающей среды, питания,
издавания звуков и т.д.
2.3. Изоляция нейронов и получение первичной культуры
Для изоляции тригеминальных ганглиев животное подвергалось декапитации и
трепанации черепа. После удаления мозга на дне основания черепа отчетливо
различались два тригеминальных ганглия. Для их извлечения перерезались
подходящие к ним нервные пути, и удалялась оболочка соединительной ткани.
Для выделения спинальных ганглиев после декапитации животное закреплялось на
подложке иглами. После удаления шкуры со спины и боков удалялась верхняя часть
хребта и спинной мозг. После этого процедура распознавания и выделения ганглиев
из позвоночника не составляла особого труда. Свежевыделенные ганглии сразу
переносились в раствор для ферментативной обработки.
Процесс ферментативной обработки ганглиев заключался в следующем:
1. Первоначально выделенные ганглии промывали в питательной среде DMEM c
добавлением буфера Hepes-NaOH 10 мМ/Л, pH 7.4 (среда 1).
2. Ганглии помещались на 30-50 мин. в раствор фосфатно-солевого буфера PBS,
содержащий 0.3% трипсина и 0.1% коллагеназы и выдерживались в термостате при
температуре 32?С. Раствор постоянно насыщался карбогеном (газ состава 95% О2,
5% СО2).
3. Тщательная отмывка после ферментативной обработки производилась в течении 10
мин. в среде 1.
После ферментативной обработки ганглии помещались в чашки Петри диаметром 35 мм
(Nunc, Дания) со средой 1. В небольшом объеме этой среде ганглии разрыхлялись
тонкими металлическими заостренными иглами и затем многократно пропускались
через стеклянную пипетку (пипетировались) с диаметром отверстия ~ 0.3 мм до
получения суспензии изолированных нейронов. Аксоны, как правило, при этой
процедуре обрывались вблизи сомы клетки. Изолированные таким образом нейроны
диаметра 10-50 мм имели форму, близкую к сферической. Суспензию нейронов разных
размеров переносили в чашки Петри диаметром 25 мм на покровные стекла. Чашки
заполнялись средой 2 следующего состава: 45% a-MEM, 45% DMEM 10% телячья
сыворотка. Жизнеспособность нейронов заметно улучшалась при использовании среды
2, в которой в тече