РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Обследовано 70 человек, больных АД, в возрасте от 14 до 70 лет, которые лечились стационарно и амбулаторно за период с 1999 по 2002 гг.
Контрольную группу составили 20 практически здоровых лиц аналогичного возраста, которые не страдают аллергическими заболеваниями, у их родителей и/или ближайших родственников аллергические заболевания также отсутствуют.
У всех больных до начала лечения изучали жалобы, проводили сбор анамнеза заболевания (включая аллергологический) и анамнеза жизни, исследовали состояние поверхности кожи и видимых слизистых оболочек, периферических лимфатических узлов, внутренних органов и систем (дыхательной, сердечно-сосудистой, пищеварительной, мочеиспускательной). По показаниям проводились консультации педиатра, невропатолога, гастроэнтеролога, оториноларинголога, стоматолога, эндокринолога, окулиста.
2.1. Клинические методы исследования
Клинические исследования у больных АД проводились с помощью традиционных методик.
2.2. Оценка состояния аутофлоры кожи
Наиболее распространенным методом изучения нормальной микрофлоры кожи является прямое исследование качественного состава микробиоценоза кожи и количества микроорганизмов путем высевания проб на элективные питательные среды. Материал с кожи можно забирать отпечатками, липкой лентой, смывом, соскобом, биопсией и т.п. Нами был выбран наименее повреждающий метод сбора материала - метод отпечатков. Микробиологическую идентификацию микроорганизмов проводили согласно Приложению №1 к Приказу №535 МЗ СССР от 22.04.85г. "Методические указания об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, используемых в клинико-профилактических учреждениях" и "Определителя бактерий Берджи".
На первом этапе идентификации проводилось культуральное исследование. Для выявления и количественного учета микробов, которые находятся на поверхности кожи, готовили бакпосевы с питательной средой: 5% кровяной агар и среда Сабуро. Теплую, свежеприготовленную питательную среду стерильно наливали на бакпосевы площадью 3,8 см2 и давали питательной среде остыть. Потом бакпосевы помещали на 18 - 24 часа в термостат при t = 37 0С для контроля стерильности среды.
Взятие посевов-отпечатков: бакпосевы с питательной средой брали только за ребра, не притрагиваясь пальцами к их поверхности, и прикладывали к коже обследуемого на 1-2 минуты, чтобы получить отпечаток. Место взятия отпечатка определяли задачами исследования: а) кожа патологических очагов - сгибательная поверхность предплечья, б) участок видимо здоровой кожи - обычно кожа живота. Потом бакпосевы помещали в термостат при t = 37 0С на 18 - 24 часа. После указанного времени инкубации проводили визуальный учет колоний, которые выросли на любой из двух использованных в работе сред. Подсчитав число колоний на отпечатке, определяли, сколько живых микробов находилось на данном участке кожи человека в момент обследования. При учете результатов посевов отмечали как общее число колоний на бакпосеве, так и характер выросших колоний.
На втором этапе проводилось бактериоскопическое исследование бактерий из колоний, которые были высеяны с кожи, и выделение чистых культур микроорганизмов.
На третьем этапе проводилась идентификация выделенных культур по их ферментативным свойствам на классических дифференциально-диагностических средах. Проводилась идентификация следующих бактерий: рода Staphylococcus (Staph. aureus, Staph. epidermidis, Staph. saprophitycus); рода Escherichia (E. coli), Streptococcus (Str. haemolyticus); дрожжеподобных грибов и трихофитов, а также типировались другие высеваемые микроорганизмы.
В конце делали подсчет числа колоний, которые выросли из любой колониеобразующей единицы (КОЕ) на 1 см2.
2.3. Иммунологические методы исследования
2.3.1. Выделение лимфоцитов из периферической крови проводили в одноступенчатом градиенте фикол-изопак по методу A. Boyum (1968).
2.3.2. Количество Т-лимфоцитов определяли методом спонтанного Т-розеткообразования (Т-РОК) с эритроцитами барана по Jondal et al. (1972). Норма составляет 52 - 70 %.
2.3.3. Оценку количества теофиллинчувствительных и теофиллинрезистентных Т-лимфоцитов проводили по методу Limatibul et al. (1978). Нормальные показатели составляют 17 - 26 % и 30 - 52 % соответственно.
2.3.4. Количество В-лимфоцитов определяли методом спонтанного В-розеткообразования (В-РОК) с мышиными эритроцитами по Dolen (1970). Норма составляет 9 - 18 %.
2.3.5. Количество иммуноглобулинов G, A, M в сыворотке крови определяли твердофазным, конурентным методом, основанным на использовании меченых антител и иммобилизованного антигена. Нормальные показатели составляют 7,5 - 17; 1,25 - 2,5 и 0,65 - 1,65 г/л соответственно.
2.3.6. Для определения уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови нами использован метод N. Digeon et al. (1977) в микромодификации. Норма составляет 0,06 ЕГ.
2.3.7. Определение общего иммуноглобулина Е в сыворотке крови проводили путем иммуноферментной тест-системы по Д.М Ивницкому с соавт. (1988). Концентрацию IgE в пробах определяют по калиброванному графику в кЕ/л (норма до 100 кЕ/л).
2.3.8. Стандартный глюкозо-толерантный тест
При выполнении стандартного глюкозо-толерантного теста больные получали натощак глюкозу в дозе 0,5 г/кг массы (рекомендации ВОЗ) и через 30, 60, 90 и 120 минут изучался уровень глюкозы в крови.
2.4. Радиоиммунологические методы
С целью изучения нарушений углеводного обмена, вызванных изменениями гормонов, регулирующих уровень сахара, исследовали функции ?-клеток поджелудочной железы путем определения уровня иммунореактивного инсулина (ИРИ) и C-пептида в сыворотке крови. Концентрация инсулина определялась методом радиоиммунологического анализа. Для оценки содержания C-пептида исполь