РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Загальна методика та об'єкти дослідження
У відповідності до мети та задач дослідження нами був проведений експеримент на 110 білих безпородних щурах-самцях з початковою масою тіла 190-215 г. Вік тварини на момент експерименту складав 3 місяці. Перед початком дослідів щурі знаходились в карантині протягом двох тижнів. Тварини були розділені на дві групи: 1 група - інтактні тварини, які утримувались в звичайних умовах віварію; 2 група - щурі, яким проводили термічний опік шкіри III А-Б ступеня, площею 9-10 % поверхні тіла (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Розподіл тварин за групами та методами досліджень.
ГрупаСвітлова мікроскопія Електронна мікроскопіяКонтроль4015Опік4015
Тварини утримувались в звичайних умовах віварію по чотири в стандартній клітці, яка забезпечувала достатній рівень рухової активності. Протягом всього експерименту за тваринами проводили систематичний нагляд та догляд. Годування здійснювалось за нормами Наказу МОЗ СРСР № 163 від 10.03.1966 р. два рази на добу. Воду не обмежували. Температуру в приміщенні, де утримували щурів, постійно підтримували в межах 24-26 ?С.
Тварин контрольної та експериментальної груп виводили з експе-
рименту після попереднього внутрішньочеревного наркозу тіопенталом натрію (з розрахунку 30-40 мг на 100 г маси тіла), шляхом декапітації через одну, три, сім, чотирнадцять та двадцять вісім діб після нанесення опікової травми шкіри. Для подальшого морфологічного дослідження були вибрані легені щурів.
2.2. Методи дослідження
2.2.1. Моделювання впливу на організм локальної гіпертермії шкіри.
Після попереднього внутрішньочеревного наркозу тіопенталом натрію (з розрахунку 25 мг/кг маси тіла), термічний опік ІІІ А-Б ступеня, що займав 9-10 % поверхні тіла, здійснювали шляхом прикладання до епільованої шкіри спини щурів з лівого боку на 6 секунд двох мідних пластин (площею 14,5 см2 кожна), які попередньо нагрівали у воді до 90?С (рис. 2.1) [196].
Рис. 2.1. Зовнішній вигляд опікової рани через сім діб після початку експерименту.
2.2.2. Макроскопічні методи дослідження.
Масу тварин визначали за допомогою чашкової ваги з точністю до 1 г. Абсолютну масу легень визначали на торсійних техніко-хімічних терезах I-го класу типу Т-200, з граничним навантаженням 200 г та з точністю при 10 % навантаженні ±25 мг.
Відносну масу легень розраховували за формулою:
Мвідн = абсолютна маса органа (мг) / маса тіла (г) х 100 (2.1)
Об'єм легень (см3) визначали за допомогою мірної колби, яка була заповнена водою (ціна поділки складала 0,2 мл).
Щільність тканини легень розраховували як відношення маси легень до їх об'єму (мг/см3).
2.2.3. Гістологічні методи дослідження.
Остільки опік шкіри наносився з лівого боку тварин, вилучення матеріалу для гістологічного дослідження в усіх випадках проводили з нижньої частки правої легені щурів.
Шматочки легеневої тканини фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну. Після фіксації матеріал промивали, зневоднювали в серії спиртів зростаючої концентрації, проводили через хлороформ та заливали в парафін [17]. Зрізи тканини товщиною 7-8 мкм готували на ротаційному мікротомі, розміщували на склі, фарбували гематоксилін-еозином та заливали в канадський бальзам.
Гістологічне дослідження тканини легень здійснювали на мікроскопі Laborlux S (Leitz) при збільшеннях: 10/0,25х10, 40/0,65х10 і 100/1,25х10.
2.2.4. Ультраструктурні методи дослідження.
Для отримання матеріалу, що використовувався для електронномік-
роскопічних досліджень у щурів під глибоким тіопенталовим внутрішньочеревним наркозом проводили трахеотомію. Після двосторонніх розрізів по міжреберним проміжкам легені спадалися, після чого в трахею зразу ж вводили приблизно 1,5 мл 2,5 % розчину глютарового альдегіду на фосфатному буфері. Після розтину грудної клітини in situ праву легеню протягом 15-20 хвилин зрошували 2,5 % розчином глютарового альдегіду. Шматочки з нижньої частки правої легені розрізали на невеликі блоки та продовжували фіксувати в тому ж розчині протягом години. Після стандартної проводки матеріал заливали в епон [221].
Напівтонкі та ультратонкі зрізи готували на ультрамікротомі LKB-3 (Швеція). Напівтонкі зрізи розташовували на предметному склі та фарбували 1 % розчином метиленового синього. Ультратонкі зрізи вкладали на мідні опорні сіточки та контрастували уранілацетатом та цитратом свинцю за Рейнольдсом [221]. Фотографування проводили на електронних мікроскопах Hitachi-9А та Hitachi-12А (Японія).
2.2.5. Мікроморфометричні методи дослідження.
Гістометричний та стереологічний аналізи тканини легень проводили на демонстраційному екрані мікроскопа Laborlux S (Leitz) при збільшенні 40/1,25х10.
Гістометричний аналіз проводили на демонстраційному екрані за допомогою штангенциркуля на поздовжніх перерізах альвеол. Він включав в себе визначення ширини та глибини альвеол, а також товщини міжальвеолярної перегородки в найвужчій і найширшій ділянках та в її середній частині, після чого визначали середнє значення товщини міжальвеолярної перегородки. Глибина альвеоли вимірювалась від площини входу до найбільш віддаленої точки куполу альвеоли. Ширина альвеоли вимірювалась в її найширшому місці. Отримані штангенциркулем показники, за допомогою об'єкт-мікрометру, переводили в мкм.
Стереологічний аналіз проводили за допомогою сітки Вейбеля [222, 223]. Він включав в себе визначення об'ємної щільності (відносний об'єм, см3/см3) просвіту альвеол та строми респіраторної частини легень за формулою:
Vvi = Pi / PT , (2.2)
де Pi- сукупне число тестових точок, що припадають на структури "i";
PT- число тестових точок.
З шматочку легеневої тканини кожної тварини методом випадкового відбору відбирали по п'ять