РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектом исследования служили органные культуры щитовидной железы, полученные от 200 новорожденных поросят, мужского и женского пола, доставленных с агрокомплекса "Слобожанский" Харьковской области, Чугуевского района, с. Граково.
2.1. Получение органной культуры щитовидной железы
Новорожденных поросят под легким эфирным наркозом декапитировали при помощи гильотины. Экстирпацию щитовидной железы производили со строгим соблюдением правил асептики и антисептики. Органное культивирование проводили по стандартной методике [65]. Щитовидные железы сразу после выделения помещали в охлажденный до 4 ?С физиологический раствор, в котором производили измельчение ткани щитовидной железы до фрагментов размером 0,3-0,6 мм3, отмывали от крови средой 199 и в этой же среде оставляли при 4 ?С на 12-14 часов. По истечении указанного срока производили замену среды 199 на среду культивирования, включающую следующие компоненты: среда 199, 10 % эмбриональная сыворотка теленка, пенициллин - 100 ед/мл и канамицин - 150 ед/мл, KI 75 мкг/л. Весовое соотношение ткани и среды составляло 1:3. Культивирование осуществляли при 37 ?С в течение 5 дней с ежедневной сменой среды культивирования. В экспериментах по изучению стимулированной секреции тиреоидных гормонов среда культивирования содержала экстракт гипофиза из расчета 10 мкл на 1мл среды и 1г ткани.
2.2. Получение экстракта гипофиза
Для получения экстракта гипофизы новорожденных поросят после экстирпации измельчали на микроизмельчителе РТ-2 и помещали в колбы на 250 мл, в которые добавляли 100 мл экстрагирующего агента (70% этиловый спирт) и настаивали 40 минут. Гомогенат фильтровали. Содержание тиреотропного гормона в экстракте гипофиза определяли радиоиммунологическим методом при помощи наборов РИА-ТТГ-ст производства "Хозрасчетное опытное производство института биоорганической химии национальной академии наук Беларуси" cогласно инструкции. При использовании 2г ткани гипофиза на 100 мл этилового спирта содержание ТТГ в экстракте составляло 126 мЕд/мл.
2.3. Исследование функциональной активности органной культуры щитовидной железы новорожденных поросят in vitro
В органотипических культурах из тканей щитовидной железы определяли уровень белка по методу Бредфорда [52], на который рассчитывали показатели уровня тиреоидных гормонов в среде культивирования ОКЩЖНП в отсутствии или при добавлении экстракта гипофиза, после экспозиции с различными концентрациями криопротектора, после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания и сроков низкотемпературного хранения, а также в процессе рекультивирования деконсервированных образцов.
Содержание трийодтиронина и тироксина определяли радиоиммунологическим методом при помощи наборов РИА-Т3-ст, и РИА-Т4-ст производства "Хозрасчетное опытное производство института биоорганической химии национальной академии наук Беларуси" согласно инструкции. Скорость ? счета определяли на ?-счетчике РСК - 350.
2.4. Исследование жизнеспособности клеток органной культуры щитовидной железы новорожденных поросят
Жизнеспособность клеток контролировали на всех этапах культивирования, при экспозиции с криопротектором, после замораживания-отогрева и в процессе рекультивирования деконсервированных образцов. Жизнеспособность определяли с использованием прижизненного красителя трипанового синего колориметрическим методом в модификации [12], которая включала этап получения суспензии клеток из органотипической культуры [5].
Для измерения количества жизнеспособных клеток ОКЩЖНП получали суспензию одиночных клеток [2]. Органную культуру инкубировали в 0,25 % растворе трипсина (на среде 199) из расчета 1 часть ткани 3 части раствора, при температуре 37 ?С при постоянном перемешивании в течение 15 минут. Трипсинизацию повторяли 3 раза. Трипсинизаты с отделившимися клетками сливали в охлажденную до 4 ?С среду 199. Все трипсинизаты объединяли и дважды отмывали охлажденной средой 199, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 минут, процеживали через слой марли и повторно центрифугировали в том же режиме. Надосадочную жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в питательной среде. К клеточной суспензии добавляли трипановый синий в конечной концентрации 0,1 % и инкубировали в течение 7 минут при 22 ?С. Далее клетки фиксировали в физиологическом растворе, содержащем 0,5 % глутаровый альдегид. Удаление фиксирующего агента и избытка красителя производили двукратным отмыванием физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 15 минут до полного обесцвечивания надосадка. Разрушение клеток для высвобождения поглощенного ими красителя производилось 0,1 н КОН. Измерение оптической плотности проводилось на фотоэлектроколориметре (КФК-2-УХЛ 42) при длине волны 595 нм. Контролем служило общее количество клеток, разрушенных 0,32 % раствором уксусной кислоты. Параллельно определялось количество жизнеспособных клеток путем подсчета в гемоцитометре.
2.5. Гистологические исследования
Гистологическому исследованию подвергались нативная, криоконсервированная при различных режимах замораживания органная культура щитовидной железы.
Материал для гистологического исследования был фиксирован в 10% нейтральном формалине, по стандартной методике заливался в парафин. Приготовленные на микротоме срезы 5-7 мкм окрашивали гемотоксилин-эозином и исследовали под световым микроскопом при увеличении 10х40 и 10х90 [16, 38, 40] Микрофотосъемку осуществляли с помощью микрофотонасадки МФНЭ-1У4.24.
2.6. Замораживание - отогрев органной культуры и её повторное культивирование (рекультивирование)
Замораживание органной культуры щитовидной железы новорожденных поросят осуществляли в присутствии димексида (фармакопейная форма диметилсульфоксида). Концентрацию димексида (ДМ) варьировали в пределах концентрации 1-9%. Димексид готовили на стерильном физиологическом растворе и смешивали при комнатной температуре с органот