РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Реактиви
У роботі були використані такі реагенти та матеріали: нітросиній тетразолій, феназинметасульфат, МТТ, ротенон, АТФ, АДФ, АМФ, аденозин, аденін, середовище "RPMI"-1640, трис-HCl (Sigma, США), НАДН, HEPES, ЕДТА (SERVA, США), тритон Х-100 (Ferak, Німеччина), силуфолові пластини (Silufol-UV254, Чехія).
Інші реактиви (сахароза, тіобарбітурова кислота, гептан, етиловий спирт, пропіловий спирт, ізопропіловий спирт, дифеніламіновий реактив, ацетальдегід, трихлороцтова кислота, аскорбінова кислота, молібдат амонію, сульфат заліза, хлорид кальцію, перекис водню, ембріональна теляча сироватка, глутамін, гентаміцин) вітчизняного виробництва кваліфікації хч та охч.
2.2. Виділення клітин та субклітинних фракцій
Досліди проводили на щурах лінії Вістар обох статей вагою 120 - 150 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію.
2.2.1. В и д і л е н н я т и м о ц и т і в щ у р і в. Після декапітації тварини проводили розтин грудної порожнини, обережно, щоб не пошкодити кровоносні судини, вилучали тимус та поміщали його у середовище RPMI-1640 або буфер такого складу (мМ): Na2HPO4 - 3, KCl - 5, NaCl - 120, CaCl2 - 1, глюкоза - 10, MgSO4 - 1, NaHCO3 - 4, HEPES - 10, рН 7,4.
Тимус відділяли від сполучної тканини та кровоносних судин і перетирали через чотири шари нейлонової сітки у буфері для виділення. Загальний об'єм доводили до 10 мл. Суспензію клітин двічі відмивали центрифугуванням (1000 g, 10 хв) у тому ж буфері. Отриманий осад клітин ресуспендували до концентрації 2-5 x 108 кл/мл. Кількість тимоцитів підраховували за допомогою світлового мікроскопу Biolam "ЛОМО" Р12 у камері Горяєва з використанням 0,2% розчину трипанового синього. Оцінку життєздатності клітин проводили за тестом з МТТ [120]. Основним принципом методу є відновлення МТТ (3-(4,5-диметил-2-тіазоліл)-2,5-дифеніл-2Н-тетразолію броміду) активними формами кисню, в результаті чого розвивається фіолетове забарвлення, яке реєструють при ?=570 нм.
2.2.2. В и д і л е н н я г е п а т о ц и т і в щ у р і в. Виділення гепатоцитів проводили з врахуванням рекомендацій різних дослідників по отриманню ізольованих гепатоцитів як ферментативним, так і неферментативним методами [47, 54, 130, 195]. На основі аналізу методичних підходів для отримання морфологічно та функціонально інтактних клітин нами була модифікована відома методика неферментативного отримання гепатоцитів [54].
Першим етапом отримання гепатоцитів була перфузія печінки in situ розчином Хенкса. Тварину швидко декапітували, розтинали черевну порожнину, підводили лігатури під v. portae та надсікали її в мезентеріальній частині. Канюлю швидко закріплювали у дистальній частині першої біфуркації v. portae, відразу надсікали v. cava caudalis, щоб запобігти набуханню печінки. Канюлю фіксували двома лігатурами. Через канюлю у v. portae вводили підігрітий до 37оС перфузійний розчин Хенкса. Відтік перфузату з печінки відбувався через v. cava caudalis. Тривалість гіпоксії печінки під час канюлювання судини не перевищувала 1 хв.
Процедуру перфузії проводили спочатку розчином Хенкса протягом 15 хв для видалення крові з судин, а потім розчином Хенкса з додаванням 2 мМ ЕДТА протягом 10 хв для ослаблення міжклітинних контактів внаслідок видалення іонів кальцію. Перфузійні розчини упродовж усієї процедури перфузії печінки піддавали оксигенації за допомогою оксигенатора бульбашкового типу. Швидкість перфузії дорівнювала 20 мл/хв. Відперфузовану печінку обережно відділяли від судин і зв'язок та переносили у середовище Хенкса без ЕДТА. Наважку тканини (350 мг) перетирали крізь чотири шари нейлонової сітки у 10 мл розчину Хенкса. Проби центрифугували (600 g, 3 хв), отриманий осад двічі відмивали за тих же умов. Отримані гепатоцити ресуспендували у розчині Хенкса до концентрації 2-3 x 107 кл/мл.
Кількість клітин підраховували в камері Горяєва, профарбовуючи їх 0,2% розчином барвника трипанового синього. Оцінку структурно-функціонального стану отриманих клітин за життєздатністю визначали за МТТ-тестом [120].
2.3. Умови постановки експерименту
Вихід тимоцитів у середньому складав 10 х 108 кл/г тимусу, а гепатоцитів - 4 х 107 кл/г печінки.
Інкубацію клітин (2-4 х 106 кл/мл) здійснювали у термостаті при 37оС у середовищі RPMI-1640 з додаванням 8 мМ NaHCO3 як джерела екзогенного HCO3-, 20 мМ HEPES та 5% ембріональної телячої сироватки для збереження високої буферної ємності середовища та стабілізації плазматичної мембрани клітин, що дозволило підтримувати функціонально-метаболічний стан ізольованих клітин протягом тривалої інкубації [1].
У роботі було застосовано такі умови експерименту:
1 - контрольну суспензію інтактних клітин інкубували протягом вказаного терміну;
2 - перед інкубацією клітинну суспензію піддавали однократному рентгенівському опроміненню;
3 - у середовище інкубації клітин додавали пероксид водню до кінцевої концентрації 0,1 або 1 мМ.
Опромінення клітинної суспензії здійснювали на установці РУМ-17 за таких умов: експозиційні дози - 2,58 х 10-2 Кл/кг (1 Гр) та 11,61 х 10-2 Кл/кг (4,5 Гр), потужність дози - 0,24 Гр/хв, фільтри 0,5 мм (Сu + Аl), напруга 200 кВ, сила струму 10 мА, фокусна відстань - 50 см.
2.4. Отримання ядерної та мітохондріальної фракцій клітин
Суспензію клітин (5-10 х 107 кл/мл) центрифугували (600 g, 3 хв) та двічі відмивали за тих же умов у розчині Хенкса від надлишку RPMI-1640 та ембріональної телячої сироватки. Для руйнування клітин застосовували гомогенізацію у щільно притертому скляному гомогенізаторі Поттера у 10-кратному об'ємі буфера №1 (мМ): сахароза - 250, KCl - 50, NaH2PO4 - 2,5, MgCl2 - 2, HEPES - 10, pH 7,4. У випадку тимоцитів процедуру гомогенізації проводили як описано у [52].
Гепатоцити, які важко піддаються руйнуванню, перед гомогенізацією переводили для набухання у гіпоосмотичний ТМК-буфер (мМ):