РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1 Методичні підходи
Для дослідження змін активності високопорогових потенціал-залежних Са2+ каналів нейронів головного мозку ссавців в умовах підвищення концентрації цитозольного натрію використовувались наступні методичні підходи:
* виділення гостроізольованих клітин із зрізів гіпокампу при використанні методу вібродисоціації нервових клітин;
* виділення гостроізольованих клітин із зрізів гіпокампу та мозочку при використанні методу м'якої ферментативної обробки нервових тканин;
* методи внутрішньо- та зовнішньоклітинної перфузії;
* реєстрація трансмембранних іонних струмів з використанням методу "петч-клемп" у конфігурації "ціла клітина";
Зміна внутрішньоклітинної концентрації натрію досягалася за допомогою: внутрішньоклітинної перфузії досліджуваного нейрона розчином, що містив підвищену концентрацію іонів натрію; високочастотної електричної стимуляції потенціал-керованих натрієвих каналів цитоплазматичної мембрани; хімічної стимуляції НМДА рецепторів цитоплазматичної мембрани клітини.
2.2 Експериментальні тварини
В експериментах використовувались білі щури лінії Вістар WAG\GSto (Москва, Росія) віком 14-16 днів, що утримувались на стандартній лабораторній дієті у віварії Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України. Вибір тварин такого віку пояснюється тим, що до цього терміну закінчується диференціація пірамідних нейронів гіпокампу та нейронів Пуркін'є мозочку[203,204], крім того, розвиток елементів сполучної тканини не зашкоджує легкій ферментативній обробці, що використовувалась для ізоляції поодиноких нейронів. Крім того, мозок молодих тварин краще витримує умови приготування препаратів зрізів і дозволяє звести до мінімуму вплив травми на реєстрацію клітинної активності.
2.3 Об'єкти досліджень
2.3.1 Гіпокамп
Той факт, що гіпокамп та мозочок є добре вивченими структурами, що відіграють важливу роль в організації центральної нервової системи, робить їх особливо привабливими для вивчення механізмів натрій-залежної модуляції високопорогових кальцієвих каналів.
Пірамідні нейрони гіпокампу, очевидно, в основному мають 5 типів кальцієвих провідностей - високопороговий з повільною інактивацією L-струм; низькопороговий транзієнтний T-струм; високопороговий зі швидкою інактивацією N-струм; високопорогові P- , Q- та Q-струми. При цьому в умовах гострої ізоляції нервових клітин частка N-струму найбільша у загальному кальцієвому потенціал-керованому струмі. Фармакологічні агенти, такі як дигідропіридини, а також ?-Aga-IVA токсин дозволяють легко виділити струм N-типу із загального кальцієвого струму. Нейрони Пуркін'є мозочку експресують потенціал-керовані кальцієві канали лише P- та T-типу. Враховуючи наведені вище суттєві відмінності в інактиваційних характеристиках цих струмів (див. пп. 1.2.3.1, пп. 1.2.3.4), з їх суми досить просто виділити P-струм. Той же час відомо, що кальцієві канали N- та P/Q- типів є основними ефекторами для G-білків (див. п. 1.3), що є основою для регуляції секреції та викиду нейромедіаторів.
Таким чином, пірамідні нейрони гіпокампу є зручною та адекватною моделлю для вивчення модуляції кальцієвих каналів N-типу, в той час як нейрони Пуркін'є - кальцієвих каналів P-типу
2.3.1.1 Морфологічні та фізіологічні особливості.
Гіпокамп - це парне сегментарне підкоркове утворення, розміщене в глибині медіобазальних відділів скроневих часток головного мозку (Рис. 2.1). Своєю незвичайною назвою він зобов'язаний особливій формі й розміщенню. У філогенетичному відношенні гіпокамп є найбільш давньою областю кори. На всьому подовженні від передніх відділів переднього мозку до задніх відділів скроневих часток, гіпокамп межує, головним чином, із мигдалеподібним комплексом і нижнім рогом бокового шлуночка. Разом із прилягаючими до нього утвореннями (зубчатою фасцією і субікулюмом) гіпокамп утворює гіпокампальну формацію.
Гіпокамп являє собою високоорганізовану структуру, що має складну внутрішню організацію і включає як спеціалізовані нейрони, так і поліморфні нервові клітини, котрі розміщені у строго визначеному порядку, що дозволяє чітко виділяти в гіпокампі за морфологічними особливостями різні області, поля, шари. Основними клітинами гіпокампу є пірамідні нейрони, що здатні продукувати правильний регулярний тета-ритм [205] і мають різні типи нервових закінчень на сомі, дендритах і дендритних шипиках. Гіпокамп має певні особливості клітинної будови, багато внутрішньо- і міжгіпокампальних зв'язків, а також численні зв'язки з іншими структурами мозку. Прослідковано тісні анатомічні зв'язки гіпокампу із структурами основного лімбічного кола, з активуючою ретикулярною формацією, неспецифічними ядрами таламуса й гіпоталамусом. На відміну від інших структур, гіпокамп характеризується сегментарною організацією. Кожний сегмент являє собою морфологічну одиницю, що здатна функціонувати самостійно й незалежно від інших.
Численні аферентні й еферентні зв'язки, прямі і опосередковані корково-підкоркові зв'язки, особливості синаптичних апаратів, своєрідність клітинної будови обумовлюють поліфункціональність гіпокампу. Особлива інтегруюча роль гіпокампу пов'язана не стільки з первинною переробкою сенсорних стимулів, скільки із сприйняттям і переробкою інформації на вищих рівнях мозку. Це, перед усім, оціночні, емоційно-мотиваційні і поведінкові функції.
Протягом кількох останніх десятиріч гіпокамп використовується як зручний об'єкт для вивчення основних принципів синаптичної організації головного мозку. Гіпокамп відповідає всім критеріям складової частини центральної нервової системи (ЦНС): це морфологічно відокремлена ділянка мозку, віддалена від сенсорних та моторних шляхів. Як одна з перших областей стінки переднього мозку, що почала диференціюватися, гіпокамп отримав назву архіокортексу, тобто давньої кори. У нижчих хребетних гіпокамп знаходиться в дорзальній частині мозку біля септальної та гіпоталамічної областей. З перебігом еволюції у вищих хребетних гіпокамп витягається та займ
- Київ+380960830922