РОЗДІЛ 2.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.
2.1. Вихідний рослинний матеріал та стерилізація листових експлантів. Як
вихідний матеріал для одержання культури волохатих коренів використовували
стерилізовані молоді листки інтактних рослин Rauvolfia serpentina. Рослини
вирощували в оранжереї при 16-годинному режимі освітлення і температурі 20-25
оС.
Свіжозрізане листя інтактної рослини R. serpentina промивали проточною водою,
потім нарізали на шматочки приблизно 2х2 см і поміщали в 70 % етиловий спирт на
2 хв, промивали стерильною дистильованою водою, після чого переносили їх у
розчин діоциду, в якому витримували при інтенсивному помішуванні 5 хв;
відмивали матеріал у 5 порціях (по 70-90 мл кожна) стерильної дистильованої
води, просушували стерильним фільтрувальним папером і переносили на агаризоване
живильне середовище 4х [295], яке містило 1-нафтилоцтову кислоту (0,5 мг/л),
1-індолілоцтову кислоту (0,5 мг/л), 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту (2 мг/л) та
кінетин (0,2 мг/л) для індукції первинного калюсу; чашки Петрі з експлантами
поміщали в термостат при 25 оС. Трансформацію проводили через 7 днів після
стерилізації.
2.2. Генетичні конструкції та бактеріальні штами. Генетичні конструкції та штам
Agrobacterium rhizogenes А4 були отримані від к.б.н. І. О. Костенюка (Citrus
research and education centre, Флорида, США).
У роботі використовували бінарний вектор на основі плазміди pBI121 [296]
(“Clontech”, США), який містив селективний маркерний ген
неоміцинфосфотрансферази ІІ (nptII) під промотором і термінатором гена
нопалінсинтетази nos, і ген b-глюкуронідази (GUS) під 35S промотором вірусу
мозаїки цвітної капусти і термінатором гена нопалінсинтетази nos (Рис. 2.1).
LB RB
PstI SphI HindIII SphI PstI XbaI BamHI SmaI SstI EcoRI
nosP nptII nosT 35S GUS nosT
Для трансформації використовували свіжонарощену нічну культуру штаму A.
rhizogenes А4, яку вирощували при 28 °С на качалці при 200 об/хв на середовищі
LB [297] з 50 мг/л канаміцину.
2.3. Трансформація за допомогою Agrobacterium rhizogenes та селекція
трансгенних коренів. Підготовлений рослинний матеріал (6-7 листових експлантів)
помiщували в 50 мл суспензiї агpобактеpiй і iнкубували на шейкері (100 об/хв)
4-5 годин пpи темпеpатуpi 25 оС. Для стимулювання vir-системи агpобактеpiй за
годину до початку трансформації в сеpедовище додавали ванiлiн в концентpацiї
500 мкМ [124]. Потiм експланти промочували стерильним фільтрувальним папером і
помiщували на агаpизоване живильне сеpедовище МS [298] без фітогоpмонiв з
клафоpаном та каpбенiцилiном (по 200 мг/л кожного) й iнкубували без свiтла пpи
темпеpатуpi 25 оС .
Через 7-8 днів пiсля появи коpенiв, їх вiдокpемлювали вiд листкiв і пеpеносили
на агаpизоване живильне сеpедовище MS без фітогоpмонiв з клафоpаном та
каpбенiцилiном (по 200 мг/л кожного) для елімінації агробактерій. Чеpез 7-8
днiв пеpеносили коpенi на агаpизоване сеpедовище MS без фітогормонів з
канамiцином (200 мг/л) для селекцiї стiйких до антибiотика коpенiв.
Культивували в теpмостатi пpи 25 оС в чашках Петpi. Кожні 10-14 днів коpенi
пеpеносили на свіжоприготовлене середовище MS без фітогормонів з канамiцином
(200 мг/л). Селективний тиск підтримували протягом 3-4 пасажів.
2.4. Культивування трансгенних коренів. Вiдселектовану коpеневу культуpу
пiдтpимували на агаризованому живильному сеpедовищi MS без фітогоpмонiв і
антибiотикiв в теpмостатi в чашках Петpi пpи 25 оС з пеpiодом пасажу 30 дiб.
Одночасно підтримували трансгенні корені на piдкому живильному сеpедовищi MS
без фітогоpмонiв і антибiотикiв з половинною кількістю макро- і мікросолей та
цукрози в колбах Ерленмейєра об’ємом 0,3 л або в банках об’ємом 0,2 л, які
містили приблизно 50-75 мл середовища на 5-10 г тканини культури, на шейкеpi
(75 кол/хв) пpи темпеpатуpi 25-27 оС в темpявi. Пеpiод пасажу - 10 дiб.
2.5. Обробка культур метилжасмонатом. 0,05 М розчин метилжасмонату (“Aldrich”,
ФРН) в 70 % етанолі додавали до культур трансгенних коренів на початку
культивування так що кінцева концентрація метилжасмонату у культуральному
середовищі становила 100 µM [74]. Відповідну кількість 70 % етанолу було додано
до контрольних культур.
Клітини та культуральне середовище збирали через 10 діб після обробки у 4-х
повторностях. Для ВЖХ аналізу вмісту алкалоїдів використовували 100 мг сухої
тканини.
2.6. Біохімічний та молекулярно-біологічний аналіз трансгенних коренів.
2.6.1. Детекція опінів у трансгенних коренях методом електрофорезу на папері.
Детекцію манопіну проводили відповідно до методики, описаної Скоттом із
співавт. [299]: 100 мг тканини гомогенізували в пробірці Еппендорф із 100 мкл
етилового спирту, після чого центрифугували 14000 об/хв 10 хв. Концентрували
зразок під потоком зжатого азоту.
Стандартний манопін (“Sigma”, ФРН) розчиняли в концентрації 1 мг/мл у
дистильованій воді. Як контроль використовували екстракт калюсної тканини R.
serpentina, приготовлений як описано вище.
Електрофорез проводили в апараті для горизонтального електрофорезу в буфері,
який містив 5 % (о./о.) мурашину кислоту, 15 % (о./о.) крижану оцтову кислоту і
80 % (о./о.) дистильовану воду протягом 45 хв при напрузі 400 В. Скляним
капіляром наносили на фільтрувальний папір Whatman 3MM по 15 мкл кожного
зразка. Зволожували папір буфером для електрофорезу і поміщали в прилад,
розташувавши зону старту з боку анода.
Після проведення електрофорезу електрофореграму висушували і занурювали в
розчин А, потім висушували і занурювали в розчин Б; після прояву плям,
висушували електрофореграму і фіксували в розчині В. Промивали електрофореграму
під потоком водопровідно
- Київ+380960830922