РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт досліджень. Отримання сперматозоїдів
Підставою для проведення даних досліджень були експерименти [45, 46], автори яких встановили зв'язок між показниками біологічної повноцінності сперматозоїдів і концентрацією К+ у свіжоотриманій та розмороженій спермі. Тому для підтвердження або заперечення цього зв'язку, а також ідентифікації біологічної повноцінності сперматозоїдів за біохімічними показниками в умовах нормального і патологічного сперматогенезу досліджували еякуляти сперми чоловіків.
Еякуляти для досліджень брали від пацієнтів центральної науково-дослідної лабораторії Львівської обласної клінічної лікарні віком 27-31 року, що відповідає періоду високої статевої активності. За родом занять вони були службовцями, робітниками і безробітними. Еякуляти ділили на 2 групи - високої та низької якості.
До першої групи відносили еякуляти, об'єм яких не виходив за межу 2-4 мл. Концентрація сперматозоїдів у них становила 60-120 млн/мл сперми, рухливість - 70-80%, а кількість патологічних форм - 20-30%. Якщо показники якості сперми виходили за межу наведених параметрів, то еякуляти зараховували до другої групи з низькою якістю сперми.
За визначеними у плазмі і сперматозоїдах концентраціями Са2+, К+ і Na+ еякуляти додатково ділили на 3 групи: з низьким (НВК), середнім (СВК) і високим (ВВК) вмістом К+. Контроль за станом структури і форми сперматозоїдів здійснювали на електронномікроскопічному рівні [44].
Визначення показників якості сперми
Об'єм еякулятів. Сперму від пацієнтів отримували в умовах лабораторії методом мастурбації у градуйовану пробірку. Перед взяттям проб пацієнт був позбавлений статевих зв'язків, вживання алкоголю і лікарських речовин. Йому також не робили масажу простати і міхурцевих залоз. Еякуляти досліджували за умов кімнатної температури (18-20?С) при природному та штучному освітленні.
Загальна кількість, або концентрація, сперматозоїдів. У лейкоцитарний змішувач до мітки 0,5 набирали свіжоотриману сперму, після чого до мітки 11 добирали 1%-ний розчин формаліну. Сперму і розчин одну хвилину енергійно струшували. Перші дві краплі суміші не використовували. Третю краплю вводили під попередньо притерте покривне скло камери Горяєва. Підрахунок сперматозоїдів вели строго по діагоналі у 5 великих квадратах. Визначену кількість клітин перемножували на об'єм еякулята і знаходили загальну їх кількість (млн/мл) у спермі.
Рухливість сперматозоїдів. Проби сперми досліджували також за допомогою лейкоцитарного змішувача, але до мітки 11 добирали теплий (37?С) фізіологічний (0,9%-ний) розчин хлористого натрію. Розбавлену сперму вводили у камеру Горяєва і підраховували кількість нерухомих сперматозоїдів, яку віднімали від визначеної загальної кількості, і знаходили відсоток рухливих форм в 1 мл сперми.
Кількість патологічних форм. Для підрахунку кількості сперматозоїдів робили мазки нативної сперми, які висушували за кімнатної температури. Висушені мазки сперми фіксували 5 хвилин у метиловому спирті і промивали проточною водою. Протягом 2-5 хвилин мазки фарбували кислим гематоксиліном, промивали проточною водою і 1-3 хвилини фіксували солянокислим етиловим спиртом (2 краплі концентрованої НСl на 100 мл 70?-ного спирту). Зафіксований препарат 20 хвилин промивали проточною водою і 2-5 хвилин фарбували 10%-ним розчином еозину. Залишки барвника два рази відмивали дистильованою водою, а готові для дослідження мазки сперми висушували на повітрі. Підрахунок кількості патологічних форм сперматозоїдів вели за допомогою біологічного мікроскопа під імерсією [135].
2.2. Пермеабілізація сперматозоїдів
Сперматозоїди виділяли методом центрифугування при 800g протягом 15 хвилин. Отримані клітини ресуспендували у співвідношенні 1:1 в охолодженому 120 мМ розчині NaCl, приготованому на 0,02 М трис-НCl буфері (рН - 7,4, при 37?С). Процедуру повторювали тричі.
Для розкриття латентних Na+,K+- та Са2+,Мg2+-АТФазних активностей до отриманої суміші сперматозоїдів додавали охолоджений 0,2%-ний розчин сапоніну. Дана методика грунтується на роботах Орлова та співавторів [106].
2.3. Визначення концентрації Са2+, K+, Na+
Визначення вмісту іонів Са2+, К+, Na+ проводили за методикою [43]. Від свіжоотриманого еякулята відбирали 0,5 мл сперми. Пробу переносили у центрифужну пробірку і добавляли одну краплю 2%-ного розчину глутаральдегіду. Фіксували сперматозоїди 5 хв і при 800g їх відокремлювали від фіксатора впродовж 5 хвилин.
До відокремлених сперматозоїдів і плазми автоматичним дозатором рідин доливали по 4,5 мл дистильованої води. Отриману суспензію клітин гомогенізували електричним змішувачем. Після цього в гомогенізованій масі та розбавленій плазмі визначали концентрацію Са2+.
Для визначення концентрації К+ і Na+ до суспензії клітин додатково приливали 5, а до плазми - 10 мл дистильованої води. В разі потреби, доливаючи воду по 5 мл, рівень розведення плазми поступово збільшували.
2.4. Оцінка структури і форми сперматозоїдів
Оцінену за показниками об'єму плазми, а також рухливості, концентрації і кількості клітин з нормальною та зміненою формою вибірку еякулятів ділили на чотири групи. До першої відносили еякуляти, біологічна повноцінність сперматозоїдів яких коливається у межах затвердженої Міністерством охорони здоров'я України фізіологічної норми [136]. Відхилення від норми у другій, третій та четвертій групах відповідали параметрам, що вказують на порушення нормального сперматогенезу і розвиток олігозооспермії І, ІІ або ІІІ ступенів.
Оцінені за принципом "норма-патологія" еякуляти додатково ділили ще на три групи, які формували за встановленими у плазмі і сперматозоїдах межами низької (НВК), середньої (СВК) і високої (ВВК) концентрації К+. Враховували також вік пацієнтів та їх відношення до робочого процесу: службовець, робітник, безробітний.
Електронномікроскопічну оцінку змін форми і ст