РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Методи досліджень
В процесі виконання досліджень основна мета їх становила: знизити частоту гнійно-запальних захворювань у породіль, хворих на ХП, шляхом вивчення особливостей перебігу пуерперію, прогнозування виникнення гнійно-запальних захворювань у післяпологовому періоді та удосконалення комплексу лікувально-профілактичних заходів, щодо попередження цих захворювань. Встановлена мета обумовила методичні особливості роботи та контингент обстежених жінок.
У всіх жінок, поряд із загальноприйнятими клініко-лабораторними та інструментальними методами обстеження, були проведені дослідження, спрямовані на вивчення гормонального та імунологічного статусу породіль, мікробного засівання сечостатевих шляхів та кишківника, стану плаценти. У новонароджених вивчали показники фізичного та нервового станів, мікробне засівання зіву та кишківника.
Стан імунної системи, згідно з даними літератури (Г.К.Степанковская, Д.В.Бабухадия, 1987; L.E.Tumanova, 1996) і Протоколу засідання Вченої Ради ІПАГ за №2 від 26.01.00 "Про затвердження методичних розробок та реагентів для виконання досліджень лабораторії імунології" вивчали таким чином: для визначення субпопуляцій лімфоцитів - Т-лімфоцитів (СD3), В-лімфоцитів (СD19), натуральних кілерів (СD16/56), супресорів-цитотоксинів (СD8), хелперів-індукторів (СD4) використовували панель моноклональних антитіл Simul test IMK Plus (Becton Dickinson, США), та аналізували на проточному цитофлуорометрі FAKSScan (Becton Dickinson, США) з використанням комп'ютерної програми Simulset Software.
В крові вагітних (37 - 38 тижнів вагітності) та породіль (5 - 7) доба пуерперію визначали відносний вміст фагоцитуючих клітин та інтенсивність фагоцитозу (за методом проточної цитометрії з використанням культури міченого FITS Stafilococcus aureus).
Концентрацію імуноглобулінів класів G, A, M в сироватці крові та імуноглобулінів А, G, M, sIgA і C3 компоненту компліменту в цервікальному слизу та грудному молоці породіль визначали методом радіальної імунодифузії в гелі за Manchini (G.Manchini, A.O.Carbonaria, T.F.Heremen, 1965) з використанням моноспецифічних антисироваток (Підприємство по виробленню бакпрепаратів ім Н.Ф.Гамалеї, Росія) проти відповідного класу імуноглоглобуліну та стандартної сироватки людини з відомими концентраціями IgG, IgA, IgM, sIgA і C3 компоненту компліменту. Концентрацію лізоциму в цервікальному слизу вагітних та грудному молоці породіль визначали за методом мікролізісу в агарі з використанням культури Micrococcus lisodeiticus.
Матеріалом для гормонального дослідження була сироватка крові жінок з ХП на 5-7 добу пуерперію. Проводили вивчення вмісту в крові естрадіолу, прогесторону, та основного регулятора лактації пролактину (Ю.Ю.Саутин, 1997). Визначали також вміст головного глюкокортикоїдного гормону людини - кортизолу. Рівень естрадіолу, прогестерону та кортизолу досліджували радіоімунним методом, за допомогою стандартних тест-наборів для визначення гормонів у сироватці крові людини. Радіометрію проводили на автоматичному гамма-лічильнику МК-15 ("Gamma", Угорщина). Визначення пролактину проводили методом імуноферментного аналізу з використанням приладу "Microweii Strip Rider " (MSR-1000, "Syntron", США).
Кількісний та якісний склад мікрофлори сечостатевих шляхів та кишківника вагітних жінок, мікробне засівання зіву та кишківника новонароджених вивчали загальноприйнятими бактеріоскопічними та бактеріологічними методами.
Секрет із зіву, вагіни та сечу брали в стерильну пробірку, готували різні розведення та засівали на різні діференційно-діагностичні середовища: Ендо, 5,0% кров'яний агар, сусло-агар з молочною кислотою, МРС-бульйон, Блаурок, МПА з пеніціліном, жовточно-соляний агар та Сабуро для грибів роду Кандіда.
Паралельно вивчали вміст дистального відділу кишківника вагітних та їх новонароджених з застосуванням кількісного методу та спеціального набору елективних поживних середовищ методом серійних розведень, згідно методичних рекомендацій "Сучасні підходи до корекції дисбактеріозу кишківника" 2000р. Засіви інкубували при 370С від 1 до 5 діб.
Видова належність лактобактерій, запропонованих до складу пробіотичної суміші визначалась на основі морфолого-культуральних та фізіолого-біохімічних властивостей.
Поживні середовища для вирощування посівного матеріалу, який пропонується до складу пробіотика, підібрано з урахуванням потреб різних груп молочнокислих бактерій. Середа MRS та MRS-1 в модифікації Ленцнера (1998) використані для зростання паличкоподібних термофільних лактобацил (таблиця 2.1). Середовища готували на дистильованій воді, стеризували при 1200С 15хв. Для приготування агаризованих середовищ додавали 1,5% агар-агару і 1,5% крейди; для напіврідких - 0,3% агар-агару.
Для визначення видової належності лактобактерій за морфологічними, культуральними та фізіологічними властивостями ізольовані штами зберігали на MRS-бульоні з 0,5% глюкози і 2,0% крейди при температурі +40С. Опис та диференціювання окремих колоній проводили на основі вивчення 48-годинних культур, що виросли на MRS-агарі з 2,0% крейди за допомогою лупи. Морфологічні властивості всіх культур вивчали в препаратах, фарбованих по Граму.
Таблиця 2.1 - Середовища для виділення молочнокислих
бактерій
КомпонентиMRSMRS-1 в модифікації ЛенцераДріжджовий автолізат
Печінковий екстракт
М'ясний екстракт
Пептон
Гідролізоване молоко
Твін-80
Глюкоза
Уксуснокислий натрій
Лимоннокислий амоній
Цистеїн солянокислий
К2НРО4
MgSO4 x 7H2O
MgSO4 x5H2O
pH
5,0
10,0
10,0
1,0
-
0,1
2,0
0,5
0,2
-
0,2
0,02
0,005
6,4 - 6,8
5,0
10,0