ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Материалом для исследования послужили интактные зубы и зубы, пораженные кариесом практически здоровых лиц обоего пола в возрасте 20-45 лет, удаленные по ортодонтическим и ортопедическим показаниям. Забор материала производился на кафедре пропедевтики хирургической стоматологии с курсом реконструктивной хирургии головы и шеи Украинской медицинской стоматологической академии. Перепараты зубов изучались с помощью световой и электронной микроскопии (табл. 2.1, 2.2).
Таблица 2.1
Количественная характеристика материала и методов его
исследования в световой микроскопии
Препараты зубовМетоды исследованиясветовая микроскопияполутонкие срезыдвухмерная фотореконструкцияИнтактные зубы63Зубы, пораженные кариесомсредний кариес177глубокий кариес135Итого3615
Сразу после экстракции, удаленные зубы промывали в физиологическом растворе. Затем, с помощью щипцов у них отсекали примерно половину длинны корней в целях создания условий для оптимального диффундирования фиксирующего раствора (4% раствор глютарового альдегида на фосфатном буфере при рН 7,4). Спустя 2 суток после промывки в фосфатном буфере, зубы подвергали декальцинации хелатобразующим агентом (Трилон-Б). По окончании декальцинации, из коронковой части зуба с помощью лезвия безопасной бритвы вырезали участки, пораженные кариесом, или соответствующие части интактных зубов, которые дополнительно фиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия. После этого их пропитывали и заключали в эпон-812, согласно требованиям, предъявляемым в трансмиссионной электронной микроскопии [154,155]. Срезы с блоков готовили на ультратоме МПС - 2, специально приспособленном для этой цели [156] и ультратоме УМТП - 7 с помощью стеклянных ножей.
Таблица 2.2
Количественная характеристика материала и методов его
исследования в электронной микроскопии
Препараты зубовМетоды исследованияметоды стереологического анализаизучение в отраженном светесканирующая электронная микроскопияИнтактные зубы62Зубы, пораженные кариесомсредний кариес174глубокий кариес133Итого369
Полученные с блоков серии полутонких срезов окрашивали толуидиновым синим.
Изучение и фотографирование объектов осуществленно на микроскопе МБИ - 3 при помощи микрофотонасадки МФН - 12 и фотоаппарата "Зенит - CD" с диафрагмой 2,5 и 1 сек. выдержкой.
В связи с тем, что при декальцинации зубов происходит полная утрата эмали, (из-за предельно малого содержания в ней органического вещества), исключающая возможность изучения на полутонких срезах реальной структуры взаимоотношений между дентином и эмалью, нами разработан комбинированный, многоцелевой метод изготовления препаратов прижизненно сохранных зубов.
Для этого, сразу после удаления и промывки в физиологическом растворе, у зубов ампутировали 1/3 длинны корней в целях оптимальной диффузии вглубь пульпы и дентинных канальцев фиксирующего раствора, которым служил 4% раствор глютарового альдегида на фосфатном буфере. Фиксацию удлиняли до семи дней. В дальнейшем, после промывки в фосфатном буфере, проводили дегидратацию зуба с переходом от спиртов к ацетону в соответствии с методами подготовки тканей для электронной микроскопии, но с двойным удлинением времени на каждом этапе.
Затем следовала тотальная пропитка целого зуба, с плавным переходом от ацетона до эпоксидной смолы эпон-812, с удлинением времени на каждом этапе в два раза. Пропитанные таким образом препараты помещали в чистую смесь эпоксидной смолы. В целях получения более твердого компаунда смолы к ней добавляли несколько больше отвердителя. Полимеризацию проводили в соответствующей размеру зуба кювете, в которой зуб помещался в необходимом для дальнейшей работы положении.
После полимеризации полученный блок разрезали сепаровочным диском с таким расчетом, чтобы получить две половины зуба. Затем торцевые поверхности с обнаженными тканями зуба подвергали щадящей шлифовке до получения ровного шлифа. В результате нами получены препараты с сохранением пульпы и твердых тканей зуба в их естественном соотношении.
После промывки в дистилированной воде и высушивания препараты окрашивали, путем погружения их на 10 минут в раствор толуидинового синего, в результате чего ткани зуба на поверхности шлифа получали окраску, интенсивность которой зависела от плотности концентрации в тканях органических веществ. В целях улучшения условий при изучении в световом микроскопе и фотографирования в отраженном свете, торцевую поверхность препаратов покрывали полистиролом под покровное стекло.
Следующий этап изучения полученных препаратов заключался в избавлении их от покровных стекол и полистирола в ксилоле, промывке в дистиллированной воде и помещении их в декальцинирующий раствор.
Здесь следует указать на одно из существенных достоинств, разработанного нами метода, заключающегося в том, что получаемый в результате распила блок содержит половину (обнаженного с торцевой, сошлифованной поверхности) зуба, который находится в массе однородного компаунда эпоксидной смолы, за исключением эмали, не подвергающейся пропитке смолой в связи с ее чрезмерно прочной кристаллической структурой. Иными словами, эмаль оказывается заключенной в объеме, который ограничен дентином и внешним слоем эпоксидной смолы. Благодаря этому она становится доступной для контролируемого травления ее вдекальцинирующем растворе в определенно заданной плоскости шлифа. Для травления эмали нами использован наиболее щадящий органические структуры, хелатообразующий агент, которым служил Трилон-Б. Под его воздействием происходит постепенное послойное вытравливание эмали из того объема, в котором она находится. В результате этого между дентином и внешним слоем эпоксидной смолы, являющимся конформным внешней поверхности зубной коронки, образуется постепенно углубляющаяся полость, глубину которой легко контролировать временем пребывания препарата в декальцинирующем растворе. Дном данной полости является глубо