Вы здесь

Корекція андрогенної функції в експериментальних тварин шляхом трансплантації нативних та кріоконсервованих органних культур сім'яників

Автор: 
Салех Дж. М. Абу Жаяб
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2004
Артикул:
0404U002853
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектом исследования служили органотипические культуры, получаемые из семенников белых беспородных крыс (100 шт.), содержащихся в условиях вивария при Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, и новорожденных поросят (100 шт.), доставляемых с Агрокомплекса "Слобожанский" (с. Граково Чугуевского района Харьковской области), а животными-реципиентами для трансплантации нативных и криоконсервированных органотипических культур алло- и ксеногенного происхождения были орхиэктомированные или с экспериментальным токсическим гипогонадизмом самцы белых беспородных крыс весом 200-230 г (200 штук).

2.1. Орхиэктомия самца крысы и модель экспериментального токсического гипогонадизма на самцах крыс

Орхиэктомию осуществляли по методике Кабак Я.М. [56], согласно которой операцию проводили под легким эфирным наркозом. Животное фиксировали на операционном столике брюшком вверх, удаляли шерсть на мошонке. Этот участок протирался спиртом и смазывался йодом. Скальпелем производили продольный разрез кожи (1-1,5 см) посредине мошонки между семенниками и удаляли по очереди каждый из семенников. Для этого, захватив пинцетом край кожи, отсепаровывали кожу мошонки от влагалищной оболочки семенника. Затем пинцетом фиксировали влагалищную оболочку семенника, производили небольшой надрез оболочки, через который при выдавливании выходил семенник с эпидермисом и жировой тканью, после чего накладывали лигатуру на семенной канатик и окружающую его влагалищную оболочку и ниже лигатуры ножницами отрезали семенной канатик, вправляли в мошонку перевязанный конец влагалищной оболочки, накладывали непрерывный шов и смазывали йодом.
Для получения животных с экспериментальным токсическим гипогонадизмом пользовались моделью, разработанной Резниковым А.Г. с соавторами [72], согласно которой однократное введение крысам 0,055 мг хлорида кадмия на 100 г веса животного вызывает развитие гипогонадизма, обусловленное изменением состояния элементов клеток, участвующих в синтезе тестостерона [72, 137].

2.2.Органотипическое культивирование тканей семенников

Для получения семенников животных с применением эфирного наркоза забивали гильотинированием. Экстирпацию эндокринных органов осуществляли с соблюдением строгих правил асептики и антисептики. Семенники сразу же после выделения помещали в охлажденный стерильный физиологический раствор, в котором производили измельчение ткани семенников на фрагменты размером 0,5-1,0 мм, отмывали от крови раствором Хенкса или средой 199 и в этой же среде в стерильных флаконах с пробками оставляли при 4ОС на 12-14 часов. Органотипическое культивирование осуществляли по методу [67]. Соотношение между тканью и средой составляло 1:6 (7) по весу. По истечении указанного срока производили замену питательной среды и помещали культуру в термостат при 32 ОС, после чего все последующие замены питательной среды осуществляли в одно и то же время каждые сутки. Питательная среда включала смесь среды 199, 0,5% гидролизата лактальбумина (1:1 по объему), в которой содержалось 15 % инактивированной эмбриональной сыворотки теленка и антибиотики (пенициллин - 100 ед/мл и канамицин - 75 мкг/мл). Культивирование осуществляли в течение 5-ти суток. После каждых суток культивирования в образцах осуществляли измерение количества белка, уровень собственной, а в отдельных случаях стимулируемой секреции гормонов. В качестве стимуляторов стероидогенеза использовали экстракт гипофиза или дибутирил-цАМФ.

2.3. Определение функциональных характеристик органотипических культур из тканей семенников

В органотипических культурах, получаемых из семенников крыс и новорожденных поросят, определяли уровень белка по методу Бредфорда [52], на который рассчитывали показатели уровня стероидных гормонов как в клетках, так и в культуральной среде, а также уровень утилизируемого холестерина.
Для определения холестерина производили экстракцию липидов по общепринятой методике [52], а непосредственное определение холестерина осуществляли с использованием тест-набора Bio-La-Test (Чехия).
Уровень тестостерона, вышедшего в среду культивирования за сутки и при проведении функционального теста (секреция тестостерона за определенные отрезки времени в инкубационную среду при 37ОС) определяли радиоиммунологическим методом с использованием тест-наборов РИА СТ-тестостерон. В отдельных случаях помимо базальной секреции гормонов определяли и уровень стимулируемой секреции. В качестве стимулятора стероидогенеза использовали 10%-й экстракт гипофиза, получаемый из органов соответствующего вида животного, или дибутирил-цАМФ в конечной концентрации 1 мМ.
В случае определения гормонов в гомогенатах предварительно осуществляли экстракцию стероидных гормонов. Образцы органной культуры гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера на льду в фиксированном объеме среды 199 и нормировали на белок. Это было связано с тем, что мы работали не с целым органом, который можно взвесить, а с органной культурой (фрагментами органа), взвешивание которой могло привести к потере части исследуемых образцов. С другой стороны, нормирование на белок является общеизвестным подходом при исследовании разнообразных характеристик на уровне клеточных суспензий. Аликвоту полученного гомогената обрабатывали гексаном для удаления липидов. Далее проводили экстракцию метиленхлоридом, поскольку его использование является приемлемым для экстракции тестостерона (Резников А.Г, 1980). Полученный метиленхлоридный экстракт осушали с использованием безводного сульфата натрия (Na2SO4) и выпаривали в вакууме. Сухой остаток разводили в питательной среде 199, для унификации результатов, полученных при измерении уровня тестостерона, секретируемого клетками в питательную среду. Мы считали, что дополнительная хроматографическая очистка в данном случае не требовалась, так как мы использовали радиоиммунологический набор, содержащий высокоспецифическую антисыворотку.