Ви є тут

Структурні характеристики та шаперон-подібна функція альфа-кристаліну кришталика ока

Автор: 
Авілов Сергій Валентинович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2004
Артикул:
0404U003864
129 грн
Додати в кошик

Вміст

розділ 2.2); крім того, частину дослідів було відтворено з використанням комерційного препарату ?-кристаліну великої рогатої худоби ("Sigma", США).
4'-N,N-диетиламіно-3-гідроксифлавон, 2-(2-фурил)-3-гідроксихромон, 6-бромметил-4'-N,N-диетиламіно-3-гідроксифлавон та 6-бромметил-2-(2-фурил)-3-гідроксихромон було синтезовано [78] та люб'язно надано к.х.н. А.С. Климченко (Університет Луї Пастера, Стразбург, Франція). Для дослідів використовували сироватковий альбумін бика, лізоцим, глутаровий альдегід, гліцин та дитіотреїтол, азид натрію, ЕДТА, інсулін свині, які було одержано від "Sigma" (США); СІТ, цистеїн та ЦПБ - від "REANAL" (Угорщина); очищений рекомбінантний інсулін людини - від "Hoehst" (Німеччина); диметилформамід і етанол (кваліфікації spectroscopy grade) - від "Merck" (Німеччина); неорганічні солі, кислоти та луги кваліфікації не нижче ЧДА.
2.2. Виділення ?-кристаліну.
?-Кристалін виділяли з кришталиків очей великої рогатої худоби віком близько одного року, вилучених негайно після забою, за методом Vanhoudt [140] з деякими змінами. Очі транспортували до лабораторії на льду. Після видалення капсул, кришталики гомогенізували за допомогою гомогенізатора Поттера в п'яти об'ємах 0,05 М натрій-фосфатного буферу, рН 7,3, що містив 0,02% NaN3. Гомогенат центрифугували за 15000 g протягом 30 хвилин при охолодженні. Супернатант наносили на 1,9?39 см колонку з "Sephacryl S-300" ("Amersham Biosciences", Швеція). Хроматографування проводили в тому самому буфері, за кімнатної температури. Білки в елюаті детектували за оптичною густиною при 280 нм. Фракції з першої половини першого піку, який відповідає ?-кристаліну, збирали та зберігали в морозильній камері до використання. Концентрацію ?-кристаліну визначали спектрофотометрично, вважаючи, що оптична густина розчину з концентрацією 1 мг/мл (Е2801мг/мл) дорівнює 0,775 [140]. Для оцінки чистоти одержаного препарату, проводили гель-фільтрацію методом FPLC на колонці з "Superdex 200" ("Amersham Biosciences", Швеція) 0,5?25 см за таких умов: швидкість елюції 0,3 мл/хв., кімнатна температура, 0,05 М натрій-фосфатний буфер, рН 7,3, 0,02% NaN3, детекція за оптичною густиною при 280 нм. Чистоту одержаних фракцій перевіряли методом SDS-PAGE (див. наступний підрозділ).

2.3. Аналітичний гель-електрофорез.
Білковий склад фракцій, одержуваних після гель-фільтрації, вивчали методом SDS-PAGE за модифікованою методикою Лемлі [116], за концентрації поліакриламіду 15%. Використовували такі буферні розчини: анодний буфер: 0,2 М трис-НСl, рН 8,9; катодний буфер: 0,1 М трис, 0,1 М трицин, рН 8,25; буфер для концентруючого гелю: 0,71 М трис-НСl рН 8,45, 0,1% SDS; буфер для розділяючого гелю: 1 М трис-НСl рН 8,45, 0,1% SDS; акриламід та метилен-біс-акриламід - у вигляді Acryl/Bis 37,5 : 1 Solution 30% ("Anachem", США). Смуги білків забарвлювали Кумасі блакитним R-250 ("Sigma", США). Маркери молекулярної маси - "Ultra-low Range Molecular Weight Marker (1,06-26,6)" ("Sigma", США).
2.4. Турбідиметричне визначення шаперон-подібної активності ?-кристаліну.
Для визначення шаперон-подібної активності ?-кристаліну використано турбідиметричний метод, заснований на здатності малих білків теплового шоку зв'язувати денатуровані В-ланцюги інсуліну, таким чином перешкоджаючи їх агрегації, індукованій дитіотреїтолом [47]. Відомо, що частки з розмірами порядка кількох нанометрів (типові розміри білкових молекул) дуже незначно розсіюють світло, але при збільшенні розмірів часток, інтенсивність світлорозсіювання різко зростає (пропорційно шостому ступеню розміру частки), що покладено в основу турбідиметричного та нефелометричного методів дослідження агрегації біомакромолекул [2,5].
У спектрофотометричну кювету послідовно додавали 1,6 мл розчину ?-кристаліну у робочому буфері (в контролі - чистий буфер), до кінцевої концентрації 0,83 мг/мл, 100 мкл розчину інсуліну (використовували очищений препарат рекомбінантного інсуліну людини або інсулін свині) до кінцевої концентрації 0,25 мг/мл. В дослідах активації ?-кристаліну під впливом підвищеного тиску або підвищеної температури, його додавали до кінцевої концентрації 0,4 мг/мл. В підготовчих дослідах нами було виявлено, що за такої концентрації інтактний ?-кристалін майже не здатний пригнічувати агрегацію інсуліну, на відміну від "активованого". Це дозволило на фоні непригніченої агрегації спостерігати збільшення активності ?-кристаліну під впливом підвищеного тиску або нагрівання. Денатурацію інсуліну ініціювали додаванням 350 мкл розчину дитіотреїтолу (кінцева концентрація - 3 мг/мл). Надалі реєстрували зміну уявної оптичної густини розчину за 400 нм, спричинену світлорозсіюванням внаслідок утворення агрегатів денатурованих В-ланцюгів інсуліну (на спектрофотометрі Cary 3 Bio ("Varian", США)). Шаперон-подiбну активність ?-кристаліну оцінювали за уповільненням росту світлорозсіювання. Кількісно шаперон-подібну активність (А) визначали за формулою:
А = 1 - D?/D?,cont, (2.1)
де D? - кінцева оптична густина досліджуваного зразка при 400 нм (кінетична крива виходить на плато через 60-90 хв. після початку інкубації), D?,cont - кінцева оптична густина контрольного зразка (без ?-кристаліну) при 400 нм.

2.5. Метод ППР.
Досліди методом ППР проводили з використанням спектрометра ППР Biosuplar-5, розробленого в Інституті фізики напівпровідників НАН України під керівництвом проф. Ю.М. Ширшова.
Для досліджень методом поверхневого плазмонного резонансу використовували сенсорні чіпи, виготовлені з кварцевого скла, з напиленим на них шаром полікристалічного золота приблизно 45 нм завтовшки. Використовували циліндричну кювету (площа дна 19 мм2, висота - менше 0,5 мм). Дном кювети є сенсорна платівка із тонкою золотою плівкою, у якій має місце явище ППР (Рис.1.4). Всі експерименти було проведено за кімнатної температури та за постійної швидкості протоку розчину через кювету спектрометра ППР, що становила 2,5 мл на годину (за винятком спеціально вказаних випадків).
При інт