РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
Геномну ДНК, виділену із печінки та крові дорослих курей лінії СВ (В12/В12), а також тотальну РНК із фібробластів 18-денного ембріона та пухлин, індукованих у курей тієї ж лінії ін'єкцією вірусного гена src, надано В.М. Степанцем та доктором J. Hejnar (Інститут молекулярної генетики, Прага, Чехія).
Маркером плавучої густини слугувала ДНК вірусу С2, оскільки її плавуча густина (1,742 г/см?) більша за плавучу густину фракцій геномної ДНК курки.
У роботі використано: набір для виділення ДНК із агарозного гелю "QIAquick PCR Purification Kit" ("Quiagen", Німеччина); набір для мічення ДНК "Random Primed DNA Labelling Kit" ("Roche", Німеччина); набір для клонування продуктів полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) "TA Cloning Kit" ("Invitrogen", США); набір для очищення плазмідної ДНК "Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System" ("Promega", США); реактиви для ПЛР та зворотньотранскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) (дезоксинуклеотидтрифосфати, хлорид магнію, буфер, Taq ДНК-полімераза, AMV-ревертаза, гексануклеотидні праймери) фірми "Roche" (Німеччина); буфер для гібридизації Rapid-hyb, [?-??Р]-мічений dCTP, [???Р]-мічений dATP, позитивно заряджені нейлонові мембрани "Hybond N+", колонки з сефадексом "NAP" фірми "Amersham" (Великобританія); колонки "Chroma Spin-10" фірми "Clontech" (США); ДНК лосося, агароза, трис(гідроксиметил)амінометан, додецилсульфат натрію, хлорид цезію фірми "Sigma" (США); фікол фірми "Pharmacia" (Швеція); полівінілпіролідон, етидіум бромід фірми "Calbiochem" (США); фільтри GF/C, папір 3ММ фірми "Whatman" (Великобританія); агар, бактотриптон, дріжджовий екстракт фірми "Difco" (США); рестриктази SacI, BamHI, полінуклеотидкіназа фага Т4 фірми "New England Biolabs" (Великобританія); рестриктази Sal, Bsp119I фірми "Fermentas" (Литва); маркер довжини фрагментів ДНК "Smart Ladder" фірми "Eurogenetec" (Бельгія). Решта реактивів - вітчизняного виробництва (марки ОСЧ і ЧДА).
2.2. Методи дослідження
2.2.1. Виявлення ALV-родинних провірусів у геномній ДНК курки. У зв'язку з тим, що ALV-родинні ендогенні ретровіруси по-різному представлені в геномі різних ліній курей, було проведено дослідження із локалізації цих ретровірусів у нефракціонованій геномній ДНК курки лінії СВ (В12/В12). Для детекції деяких провірусів родини ev (ev-1 - ev-4, ev-6, ev-7, ev-9, ev-12, ev-15, ev-16, ev-21) використовується полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) з праймерами, специфічними для довгих кінцевих повторів (LTR) кожного провірусу і сайту його інтеграції. Ампліфікацію проводили на апараті "DNA Thermal Cycler" ("Perkin Elmer", США). Реакційна суміш об?ємом 50 ?l містила: 50 mM KCl, 10 mM трис-HCl pH 8,8 (при 25° С), 1,5 mМ MgCl2, 0,2 mM dNTP кожного типу, 1 од. Тaq-полімерази, по 50 pM кожного праймера та 100 нг геномної ДНК. Нуклеотидні послідовності праймерів та температурні цикли ПЛР наведено в табл. 2.1.
Решту ALV-родинних ретровірусів можна виявити за допомогою методу поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ). Гідроліз 10 мкг геномної ДНК рестриктазами BamHI та SaсI (по 30 од. кожної) проводили протягом 12 годин. Електрофорез ДНК робили у горизонтальному 0,8% агарозному гелі при напрузі 1 В/см 14 годин у трис-боратному буфері [161]. Переніс ДНК із агарозного гелю на мембрану Hybond N+ ("Amersham", Великобританія) проводили за загальноприйнятою методикою [162]. ДНК фіксували на мембрані протягом 2 годин при 80? С. Зонд мітили радіоактивно, використовуючи [?-??Р]-мічений dCTP та "Random Primed
Таблиця 2.1
Умови ПЛР для ALV-родинних ретровірусів [за даними 163]
Ретро-вірусПраймери, 5'-3'Температурні циклиev-1ev1.up: gcaccaaacaatctagtctgtgc
ev1.dwn: aagtactcacttctctgaac
LTRA: cctgaatgaagcagaaggcttc [94°-1хв;56°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;53°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;50°-1хв;72°-1хв]-30 циклівev-2ev2.up: gcaccactgatgggattcttgttctc
LTRE: gtgttcgcaatcgttagggactc
[94°-1хв;65°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;63°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;61°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;59°-1хв;72°-1хв]-28 циклівev-3еv3.up: gaaatgcctgccccatgccagtg
еv3.dwn: cttctccagcttcagtgacgc
LTRA: cctgaatgaagcagaaggctt c
[94°-1хв;65°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;62°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;59°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;56°-1хв;72°-1хв]-28 циклів
ev-4
ev4.up: taaattctaagacactgacaatct
ev4.dwn: cataattctacgtaggcaacagct
LTRB: acctgaatgaagctgaaggcttc [94°-1хв;64°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;61°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;59°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;56°-1хв;72°-1хв]-30 циклів
Продовження табл. 2.1
ev-6ev6.dwn: cacagccctatgtggcacttcaagg
LTRA: cctgaatgaagcagaaggcttc[94°-1хв;66°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;63°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;60°-1хв;72°-1хв]-30 циклівev-7ev7.up: cacatttataatacaagcatgttct
ev7.dwn: cttggctctgctacaatgcagta
LTRC: tgtagtcaaatagagccagagg [94°-1хв;63°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;60°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;57°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;54°-1хв;72°-1хв]-30 циклівev-9ev9.up: tagtgcacatataatttcagatgagtt
ev9.dwn: cattctccatgcacctgaagtg
LTRB: acctgaatgaagctgaaggcttc[94°-1хв;60°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;58°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;56°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;53°-1хв;72°-1хв]-30 циклівev-12ev12.up: gaacttccaaaggactgataagaga
ev12.dwn: ttgaggcaggaattggcaacac
LTRD: cgcccatatgtccttgcgtc [94°-1хв;61°-1хв;72°-1хв]-3 цикли
[94°-1хв;59°-1хв;72°-1хв]-3 цикли
[94°-1хв;57°-1хв;72°-1хв]-28 циклівev-15ev15.up: caaatgagggtaataagggag
ev15.dwn: cactaccaaatataattctgtag [94°-1хв;58°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;55°-1хв;72°-1хв]-3 цикли
[94°-1хв;52°-1хв;72°-1хв]-28 циклівev-16ev16.up: caatccagcctgtctaggtac
ev16.dwn: gtagtccacctagacatcagca [94°-1хв;65°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;63°-1хв;72°-1хв]-2 цикли
[94°-1хв;60°-1хв;72°-1хв]-30 циклів
Примітка. Кожна реакція починається денатурацією ДНК при 94° протягом 3 хвилин і за