ГЛАВА 2
материалы И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Постановка эксперимента
В работе использовали самцов и самок белых крыс линии Wistar полутора и
трехмесячного возраста, весом 75-110 и 180-250 г соответственно (самки в
количестве 370, их потомки обоего пола в количестве 768), которые содержались в
стандартных условиях вивария Института проблем эндокринной патологии им. В. Я.
Данилевского АМН Украины.
Исследования проводились в соответствии с национальными "общими этическими
принципами экспериментов на животных" [151], которые согласуются с положениями
"Европейской конвенции о защите позвоночных животных, использующихся для
экспериментальных и других научных целей"(Страсбург, 1985).
Материалом в экспериментальных исследованиях выступали гомогенат печени,
цельная кровь и сыворотка крови крыс, декапитированных после анестезии
хлоралозо-уретановым наркозом.
С целью моделирования условий, характерных для гестационного сахарного диабета,
а именно – нарушение толерантности к углеводам в период беременности без
существенного повышения базальной гликемии, самкам на вторые сутки беременности
проводилась однократная внутрибрюшинная инъекция стрептозотоцина в
субдиабетогенной (подобранной экспериментально) дозе 45 мг на кг массы тела
(на 0,1 M цитратном буфере, рН 4,5) [10].
Стрептозотоцин (STZ) – антибиотик
(2-дезокси-2-метилнитрозамино-карбонил-амино-D-глюкопираноза), оказывает
избирательное воздействие на панкреатические бета-клетки. Фрагмент
нитрозомочевины отвечает за токсическое действие препарата, а 2-дезоксиглюкоза
– за селективность эффекта по отношению к бета-клеткам [152]. В панкреатических
бета-клетках STZ вызывает разрыв в молекулах ДНК, что приводит к активации
процессов репарации при участии фермента поли-АДФ-рибозо-синтазы, который в
качестве субстрата использует НАД и таким образом способствует исчерпанию его
запасов в бета-клетках и их гибели [153]. Следовые количества STZ, а также
продукты его распада попадают в печень и почки, откуда выводятся в течение
суток, что обеспечивает защиту формирующегося эмбриона от токсического
воздействия [154]. Кроме того, в матке отсутствует специфический глюкозный
транспортер GLUT2 [1], сродством к которому обладает STZ.
Учитывая, что STZ очень нестабилен в водном растворе, его вводят в организм не
позднее, чем через 5 мин после разведения в буфере. Описанная модель
характеризуется нарушенной толерантностью к углеводам и относительной
инсулиновой недостаточностью: снижением секреции инсулина в ответ на повышенный
уровень глюкозы крови и сохранением секреторной реакции на неглюкозные
секретогены у экспериментальных животных [10].
Для моделирования материнского социально-эмоционального стресса самка ежедневно
на протяжении первого триместра беременности (со вторых по восьмые сутки) в
течение светлого времени суток (6 ч) помещалась в новую клетку с незнакомым ей
сообществом из 25 небеременных половозрелых самок. На ночь животное отсаживали
в отдельную клетку [155].
Несмотря на то, что большинство работ, описывающих влияние материнского стресса
на формирование органов и систем потомства, посвящены изучению нарушений на
поздних сроках беременности, нами была выбрана модель стресса в первом
триместре беременности. Основанием для этого явилась недостаточная изученность
проблемы, а также то, что в экспериментальных исследованиях беременности,
отягощенной СД, было отмечено, что сроки максимальной тератогенной
чувствительности эмбриона крыс приходятся на 6-11 сутки беременности [14, 82,
83], то есть конец первого – начало второго триместра. Кроме того, в ряде
экспериментальных работ отмечена интенсификация углеводного метаболизма,
приводящая к активации электрон-транспортной цепи митохондрий и повышению
генерации в ней АФК у доимплантационных эмбрионов с диабетическим окружением
[156, 157], что свидетельствует о раннем повреждающем воздействии материнской
гипергликемии.
Таким образом, при исследовании влияния материнского стрессирования в условиях
гестационного диабета использование модели стресса на ранних сроках
беременности является патогенетически обоснованным.
При исследовании чувствительности к диабетогенному действию STZ потомков,
полученных от матерей с гестационной инсулиновой недостаточностью и/или
стрессом в период беременности, животным проводилась однократная
внутрибрюшинная инъекция субдиабетогенной дозы STZ (35 мг на кг массы тела) в
период пубертата или в половозрелом возрасте.
При исследовании способности к адаптации потомков, полученных от матерей с
гестационной инсулиновой недостаточностью и/или стрессом в период беременности,
подвергали кратковременному воздействию гипокинезии (ГК). Для моделирования
гипокинезии животное помещалось на 1 час в пенал для обездвиживания [158].
Для оценки возможности превентивного и реабилитирующего терапевтического
воздействия на развивающиеся у потомков стрессированных матерей с диабетом
нарушения в работе системы глюкозного гомеостаза и АОЗ были проведены две серии
экспериментов. Применялись две модели антиоксидантной терапии (АОТ), снижающие
оксидативное воздействие на разных этапах онтогенеза – в пренатальном (закладка
и формирование систем) и препубертатном (интенсивный рост) периодах. В первом
случае матери исследуемых впоследствии экспериментальных животных получали
раствор витамина Е (solutio б-tocoferoli acetatis 10% oleosa фирмы «Киевский
витаминный завод») со 2-х по 15-е сутки беременности перорально в
терапевтической для животных дозе 50 мг на кг массы тела [159]. Во втором
случае потомки стресс
- Київ+380960830922