РОЗДІЛ 2
Матеріали та методи дослідження
При дослідженні впливу гіпоксії на внутрішньоклітинний обмін Са2+ у сенсорних
нейронах щура використовувались наступні методичні підходи:
Виділення гостроізольованих нейронів гангліїі дорсального корінця щура;
Реєстрація змін внутрішньоклітинної концентрації кальцію за допомогою
флуоресцентного методу з використанням кальцій-чутливого зонду Fura-2 АМ;
Моделювання гіпоксичного стану шляхом заміни кисню на азот у позаклітинному
середовищі;
Контроль вмісту кисню у навколоклітинному просторі за допомогою
полярографічного методу з використанням платинового електроду;
STZ-індуковане моделювання цукрового діабету другого типу.
2.1. Об’єкт дослідження. Загальна характеристика сенсорних нейронів ганглій
дорзального корінця щура
Первинні сенсорні нейрони ссавців являють собою псевдоуніполярні клітини.
Нейрони гангліїв дорсальних корінців забезпечують проведення соматичної та
вісцеральної сенсорної інформації від периферичних тканин до спинного мозку.
Відростки цих нейронів здійснюють рецепцію внутрішніх і зовнішніх подразників і
передачу порушення до вторинних сенсорних нейронів центральної нервової
системи, що знаходяться в дорсальних рогах спинного мозку.
Залежно від розміру соми DRG нейрони поділяють на великі (діаметр соми дорівнює
45 ? 51 мкм), малі (діаметр соми 20 ? 27 мкм), а також середні нейрони з
діаметром соми 33 ? 38 мкм, що інколи виділяються як окрема група [213]. Існує
кореляція між розмірами соми нейронів та швидкістю проведення потенціалу дії по
їхніх аксонах. Нейрони гангліїв дорсальних корінців діляться на великі нейрони
із великою швидкістю проведення (більше 14 м/с) і малі нейрони із повільною
швидкістю проведення (менше 8 м/с).
В залежності від типу аксону DRG нейрони поділять на клітини типу А (аксон
великого діаметру) та С (аксон малого діаметру). Нейрони з малим діаметром
аксону та малою сомою клітини проводять сигнали від терморецепторів та больову
(ноцицептивну) інформацію. Нейрони з великим діаметром аксону та великою сомою
проводять тактильну та проприоцептивну інформацію.
В даних експериментах отримані результати аналізувалися окремо для малих та
великих нейронів, оскільки існують дані про різницю в кальцієвому гомеостазі
клітин в залежності від їх розміру [214,215]. Просторове сканування полю зору
мікроскопу за допомогою дисектору дозволяло визначати розмір клітин із похибкою
не більше ±2 мкм.
2.2. Ферментативне виділення окремих DRG нейронів
Експерименти, що описані в даній роботі, проводились на гостроізольованих
нейронах гангліїв дорзального корінця білих щурів лінії Вістар віком 1,5-2
місяці, що утримувались на стандартній лабораторній дієті у віварії Інституту
фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Для отримання клітин
використовувалась стандартна процедура ферментативної ізоляції. Щура
декапітували під легким ефірним наркозом. З області хребта хірургічним шляхом
видалялась шкіра та м’язи, хребет розсікався навпіл в горизонтальній площині та
виділялися грудні та поперекові спинномозкові ганглії, які поміщалися у чашку
Петрі з охолодженим до 4 °С розчином DPBS з глюкозою. Після 2-3 хвилин
охолодження ганглії під мікроскопом відчищалися від залишків нервових волокон
та зайвої сполучної тканини і переносилися у розчин Tyrode, що містив ферменти
колагеназу (тип ІА, Sigma, США) в концентрації 0.5 мг/мл та протеазу (тип XIV,
Sigma, США) в концентрації 1 мг/мл, в якому витримувалися на протязі 25-30
хвилин при температурі 37 °С. Для усунення залишків ферменту та запобігання їх
подальшої дії ганглії інкубувались в насиченому розчині білка альбуміну в DPBS
1 мг/мл (Sigma, США) на протязі 10 хвилин при 37 °С, після чого відмивалися
чистим розчином DPBS 5-6 разів на протязі 10 хвилин при цій же температурі. Для
отримання суспензії клітин ганглії піпетувалися за допомогою Пастеровських
піпеток різного діаметру у 0.5 мл розчину Tyrode. Отриману суспензію
витримували у чашках Перті на протязі 20-30 хвилин для закріплення клітин до
дна чашки. В експерименті клітини використовували на протязі 4-6 годин після
виділення.
2.3. Властивості флуоресцентних кальцій-чутливих барвників
Найбільш широко розповсюджені у використанні індикатори Са2+ являють собою
хімічні флуоресцентні зонди, тому що їх сигнал (світло) є достатньо великим для
вимірювання змін [Са2+]вн у порівнянні з іншими типами Са2+ індикаторів.
Більшість класичних представників цієї групи були розроблені Ченом та його
співробітниками [216,217]. Існує декілька різних видів флуоресцентних Са2+
індикаторів, і необхідно вибрати найбільш підходящий зонд для конкретного
експерименту. Зонди можна поділити на різні групи на основі декількох різних
критеріїв. Один шлях поділу зондів на дві групи полягає у віднесенні їх до
радіометричних (двохвильових) або нерадіометричних (однохвильових) індикаторів.
До перших належать Indo-1 та Fura-2, до других Fluo 3, клас „calcium green” та
Rhod 2. Іншими важливими критеріями для поділу є спектри збудження/емісії.
Спектри поглинання індикатора, наприклад у ультрафіолетовому чи видимому
(синій, зелений або красний) діапазоні хвиль мають бути ретельно вивчені для
оптимального підбору та максимальної продуктивності джерела збуджуючого світла.
Зокрема при використанні одно- або багатофотонних лазерів збудження, довжина
хвилі збудження виставляється так, щоб максимальна спектральна здатність
поглинання індикатору була присутня у доступних довжинах хвиль лазера у
системі. В останні роки все частіше використовується множинне забарвлення для
одночасного аналізу різних параметрів, наприклад [Са2+] та рН [218], [Са2+] та
мембранний потенціал або [Са2
- Київ+380960830922