Ви є тут

Активність тирозинових протеїнфосфатаз в лімфоїдних клітинах щурів за умов впливу іонізуючого випромінювання

Автор: 
Богданова Олена Вікторівна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2005
Артикул:
0405U002737
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2

Тирозинпротеїнфосфатаза CD45 - регуляторний фермент в процесах передачі сигналу у клітинах гематопоетичного ряду
СD45 - це трансмембранна ТПФ-аза, протеїн-тирозин O-фосфотрансфераза (КФ 3.1.3.48) [68,69], основними функціями якої є регуляція процесів проліферації, розвитку, диференціювання та антигенної активації [70], інтегрин-опосередкованої адгезії [71] та міграції клітин гематопоетичного ряду. Те, що цей фермент складає помітну частину білків клітинної поверхні, робить його важливою ланкою в регуляції потоку сигнальних процесів крізь мембрану. СD45 являє собою довгу одноланцюгову трансмембранну молекулу (рис.2.1), яка складається з 1120-1281 амінокислотних залишків і пронизує мембранний бішар один раз.
Молекулярна вага ферменту змінюється у межах 180 - 220 кДа. До складу функціонально важливих доменів СD45 входять глікозильований зовнішньоклітинний, трансмембранний та два цитоплазматичні тирозинпротеїнфосфатазні домени. Характерною особливістю ензиму є складність будови зовнішньоклітинного NH2-кінцевого домену, який суттєво відрізняється від таких у інших рецептороподібних ТПФ-аз [72]. Структурні особливості зумовлюють жорстку стиржневидну конформацію цього домену [73], який містить дві гетерогенні за своїми властивостями ділянки. Ближча до N-кінця молекули ділянка є високоглікозильованою, не містить цистеїну, є високо зарядженою і має велику кількість залишків, що перешкоджають утворенню ? - спіралі. Інша, наближена до мембрани ділянка збагачена на залишки цистеїну і містить 1-2 "фібронектин типу ІІІ" послідовності [74]. Розмір зовнішньоклітинного домену варіює від 391 до 552 амінокислотних залишків (від 28 до 51 нм) [75].
А
Рис.2.1. Структура трансмембранної ТПФ-ази CD45 лімфоїдних клітин:
А- схематична;
Б- трьохмірна структура цитоплазматичного домену.
У залежності від результатів альтернативного сплайсингу мРНК ферменту (екзонів 4, 5 та 6) виникає декілька ізоформ, що відрізняються складом свого зовнішньоклітинного домену - 180 кДа у тимоцитах, 180, 190, 200, 220 кДа у Т-клітинах та 240 кДа у В-клітинах Завдяки ції антигенній гетерогенності існує декілька типів антитіл, які розпізнають антигенні детермінанти цих ізоформ (табл.2.1) [73,76,77].
Зміна глікозилювання СD45 як мажорного компоненту мембрани сильно впливає на зовнішньоклітинні взаємодії лімфоїдних клітин [73]. Крім цього, із зовнішньоклітинним доменом СD45 може бути ковалентно зв'язаний незвичайний сфінголіпід, який в своєму складі має міристоїлову кислоту [78].
Після встановлення первинної послідовності молекули CD45 і ідентифікації гомологічності її цитоплазматичної частини каталітичним доменам інших ТПФ-аз [79], вона була класифікована як фермент даного класу. Рисою, властивою багатьом ТПФ-азам, є наявність двох повторюваних каталітичних доменів на СООН-кінці молекули - мембранопроксимального D1 та мембранодистального D2 [80].

Таблиця 2.1
Ізоформи СD45 та специфічні до них антитіла

Ізоформи СD45Екзони, які підлягають
альтернативному сплайсингуАнтитілаCD45RACD45RBCD45RCCD45ROСD45 ?345678+++-СD45 ?34678++--СD45 ?34678+-+-СD45 ?35678-++-СD45 ? 348+---СD45 ?358-+--СD45 ?368--+-СD45 ?378---+СD45 і38---- + - специфічне пізнання;
- - пізнання відсутнє
* CD45 RA - антитіла, що пізнають екзон А (= екзон 4)
* CD45 RВ - антитіла, що пізнають екзон В (= екзон 5)
* CD45 RС - антитіла, що пізнають екзон С (= екзон 6)
* CD45 RО - антитіла, що є специфічними до молекули, яка не містить жодного з цих екзонів.
У СD45 лише D1 має чітко виражену каталітичну активність[81,82]. Цей домен утримує висококонсервативну послідовність, яка містить важливі для перебігу каталітичного акту залишки аргініну та цистеїну [83]. Цей факт було підтверджено даними мутаційного аналізу [81,84]. Ідентичні мутації в D2 не впливають на ТПФ-азну здатність CD45 [72].
Можливо, D2 не проявляє суттєвої активності, тому що в його структурі важливі для каталізу амінокислотні залишки є заміненими на інші [85]. Проте він утримує регуляторні сайти серинового фосфорилювання [73] і його наявність є необхідною для нормального функціонування ферменту [81]. Це підтверджується дослідами in vivo, в яких спостерігається відміна CD45- залежної продукції інтерлейкіну-2 в клітинах, де D2 домен є замінений аналогічним доменом іншої ТПФ-ази [86]. У нативному стані ТПФ-аза CD45 є високофосфорильованою [87] і не здатна до автодефосфорилювання [88]. Фосфорилювання з боку цитоплазматичної серин-треонінової казеїнкінази 2 значно підвищує активність ферменту. Зниження фосфорилювання молекули ферменту, спряжене з інкубацією клітин з іономіцином, пригнічує активність CD45 [89]. Тирозинове фосфорилювання ферменту з боку p50csk ТПК-ази створює адапторний зв'язуючий сайт для p56lck ТПК-ази - однієї з головних субстратних молекул CD45 і збільшує фосфатазну активність [90]. Треба зазначити, що окремий D2, отриманий обмеженим протеолізом, здатний до каталітичної активності [91].
ТПФ-азні домени містять приблизно 240 амінокислотних залишків кожний і розділені спейсерною ділянкою довжиною 56 амінокислот [73]. Ця ділянка між двома каталітичними доменами СD45 здатна асоціювати з D2 доменом. Показано, що така взаємодія може мати місце не тільки інтрамолекулярно, а й між двома молекулами СD45 [92], що може мати значення для димеризації ферменту. Послідовність амінокислот, що є розташованою між мембраною та каталітичними доменами також є важливою для функціонування ферменту [73,82].
Було встановлено, що до складу активного центру ферменту входить активний залишок цистеїну, про що свідчить чітка залежність ензиматичної активності від наявності у середовищі інкубації сульфгідрильних редукуючих агентів і інгібування швидкості реакції речовинами, що здійснюють алкілування [88,93]. Загальним для реакцій тирозинового дефосфорилювання є механізм, який включає в себе ко