ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Общая характеристика работы
В работе использовались крысы самцы линии Вистар. Животные обеспечивались стандартным рационом питания и содержались в условиях естественного освещения помещения вивария.
В исследованиях использовалось 238 крыс. Животные делились на две возрастные группы: взрослые - 10-12 месяцев (масса 250 - 350 г) и старые - 22-25 месяцев (масса 450-530 г). Каждая группа, в свою очередь, делилась на три подгруппы: 1 - интактные (взрослые - 59; старые - 42), 2 - крысы, подвергнутые иммобилизационному стрессу (взрослые - 39; старые - 32), 3 - животные, которым за 60 минут до иммобилизации внутрибрюшинно вводился раствор экстракта аронии (Aronia melanocarpa) на физиологическом растворе хлористого натрия в дозе 0,2 г / кг массы (взрослые - 34; старые - 32).
Работа выполнялась с учетом положений "Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных".
2.2. Характеристика использованной модели иммобилизационного стресса
Для воспроизведения модели иммобилизационного стресса крысы подвергались обездвиживанию путем привязывания за конечности спиной к неподвижной опоре (доске). Экспозиция - 30 минут. После этого животные немедленно подвергались декапитации под легким эфирным наркозом.
Эффективность воспроизведения иммобилизационного стресса контролировалась путем определения концентрации адреналина и 11-оксикортикостероидов в сыворотке крови. Полученные данные представлены на (рис. 2.1).
Результаты изучения уровня адреналина и 11-ОКС в крови, свидетельствуют о том, что 30-ти минутное обездвиживание животных сопровождалось формированием у них состояния иммобилизационного стресса (Г. Селье, 1960; Ф.З. Меерсон, 1981, 1984; Е.М. Микаэлян и соавт., 1983; Л.Е. Панин, 1983).
Рис. 2.1 Изменение концентрации адреналина и 11- оксикортикостероидов в крови крыс при 30-минутной иммобилизации (содержание исследуемых веществ в крови интактных животных принято за 100%; P < 0,05 к интактным животным).
В специальных экспериментах с целью коррекции изменений со стороны свободнорадикальных процессов в тканях внутренних органов крыс, подвергнутых 30-минутной иммобилизации, животным перед обездвиживанием вводился новый перспективный антиоксидантный препарат - экстракт аронии (О.И. Ипатова, В.Н. Прозоровский, 2000). Препарат очищенного сухого экстракта аронии был получен из Государственного учреждения научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича (г. Москва).
2.3. Подготовка проб для изучения концентрации продуктов свободнорадикального окисления и субклеточного фракционирования гомогенатов
Животные декапитировались. Извлекались полушария головного мозга и сердце, которые немедленно помещались в жидкий азот. Для определения концентрации продуктов свободнорадикального окисления липидов и белков, навески замороженной ткани подвергались экстракции в соответствии с процедурами, описанными в разделе 2. 4.
В специальных экспериментах, с целью проведения субклеточного фракционирования, извлеченные головной мозг и сердце немедленно помещались в охлажденный до 40 С 0,9% раствор хлористого натрия и тщательно отмывались от крови. После этого они отжимались на марлевой салфетке, взвешивались на торсионных весах и измельчались ножницами. Навески измельченного мозга гомогенизировались в течение 1 минуты (25-30 движений пестика), а сердца - в течение 3 минут в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма с тефлоновым пестиком при отношении массы ткани к объему среды выделения равном 1:10.
Среда выделения для мозга представляла собой 0,32М раствор сахарозы, содержащий 0,01М ТРИС (рН 7,4), а для сердца - 0,25М раствор сахарозы, содержащей 0,01М ТРИС (рН 7,4). Приготовленные гомогенаты фильтровались через 2 слоя марли и центрифугировались в течение 10 минут при 1000 g в центрифуге ЦЛ-310b (Польша). Надосадочная жидкость подвергалась повторному центрифугированию при 10000g в течение 20 минут на рефрижераторной центрифуге РС-6. Полученный супернатант далее использовался в исследованиях в качестве постмитохондриальной фракции. Осадок, полученные после центрифугирования пробы при 10000g, суспензировался с 5 мл среды выделения и подвергался повторному осаждению при аналогичном режиме центрифугирования. Очищенный таким образом осадок суспензировался с 1 мл среды выделения и использовался в исследованиях в качестве грубой митохондриальной фракции.
Все процедуры, связанные с фракционированием гомогенатов мозга и сердца проводились при 0 - +040 С. Схема фракционирования гомогенатов представлена на (рис. 2.2).
Рис. 2.2 Схема фракционирования гомогенатов.
С целью получения микросомальной фракции к постмитохондриальной фракции добавлялась смесь (конечные концентрации) CaCl2 (8 mM) и MgCl2 (5 mM) (Ж. Де-Пьер, Г.Далльнер, 1979). Пробы выдерживались 15 минут при 4оС и центрифугировались при 5000g в течение 10 минут. Осадок суспензировался с 1 мл среды выделения и использовался в качестве микросомальной фракции, а надосадочная жидкость - в качестве цитозольной фракции.
Пробы субклеточных фракций полушарий мозга и сердца до проведения исследований хранились при -200 С.
2.4. Биохимические методы исследований
2.4.1. Определение содержания продуктов свободнорадикального окисления
Для оценки состояния свободнорадикальных процессов в мозге и сердце, в них измерялось содержание продуктов свободнорадикального окисления липидов и белков, определялась интенсивность индуцированного свободнорадикального окисления и исследовалась активность ферментов первой линии антиоксидантной защиты.
В работе проводилось изучение концентрации продуктов свободнорадикального окисления липидов (диеновых конъюгатов и шиффовых оснований), а также карбонилиро