РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єм експериментальних досліджень
Для вирішення питань, які випливають із задач даної дисертаційної роботи, на різних групах тварин було проведено експериментальні дослідження та клінічні спостереження за допомогою загальноприйнятих методик і апаратури.
Дослідження проводилось на 48 кроликах (96 очей) породи Шиншила, масою 1,5 - 2,0 кг, різної статі, приблизно одного віку (1 рік), які перебували в умовах віварію зі стандартним раціоном харчування і утримувались згідно належних санітарно-гігієнічних вимог. Роботу із експериментальними тваринами проводили у відповідності з вимогами, викладеними у "Європейській конвенції захисту хребетних тварин, яку застосовують для експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург, 18.03.86 р.)" і користуючись наказом МОЗ УРСР №32 від 22 лютого 1988р.
Для роботи ми використали експериментальну модель ВМД сітківки кроликів. Опромінення кроликів проводилось в режимі світлового дня з 9.00 до 18.00 год. щодня в квадратній кімнаті площею 10 м2 в умовах кондиціонування повітря дуговою ртутно-вольфрамовою лампою типу ДРФ-1000 (довжина хвилі 350-1150 нм, щільність потоку світлової енергії 30 мВт/см2, напруга 220 В, потужністю 1000 Вт). Лампа була розміщена в центрі кімнати на рівній відстані від підлоги та стелі. Тварини знаходились у клітках із решітчастими боковими стінками. Задня стінка була заклеєна сріблястою фольгою. Інтенсивність опромінення на рівні клітки вимірювали приладом М210 Cog. Rad.
Всі кролики були поділені на три групи - контрольну і дві експериментальні. Група контрольних тварин - 14 кроликів (28 очей) перебувала у стандартних умовах віварію. Першу групу експериментальних тварин - 17 кроликів (34 ока) опромінювали світлом високої інтенсивності, по спектральному діапазону максимально наближеному до сонячного (350 - 1150 нм) за описаною вище методикою. Другу групу складали експериментальні тварини - 17 кроликів (34 очей), які крім опромінення світлом високої інтенсивності отримували ацетоамінофен per os щодня в кількості 50 мг/кг маси. Ацетоамінофен - ксенобіотик, який давали експериментальним тваринам з метою зниження в організмі рівня тіолової форми глютатіону. Ксенобіотик активуючи глютатіон-S-трансферазну реакцію зв'язується з тіоловою формою глютатіону і виводиться з організму [156, 196]. Таке прискорене використання глютатіону в організмі відбувається у процесах детоксикації під час захворювання.
Патологічні зміни очного дна кроликів оцінювали за допомогою непрямого бінокулярного офтальмоскопу НБО-2.
Тварин виводили з експерименту в стані глибокого наркозу (1 мл 10% розчину тіопентаналу натрія на кг маси) методом повітряної емболії.
Очі були енуклеовані на льоду при температурі 0 - 5?С. Для досліджень використовували сітківку, з якої готували гомогенат з використанням 0,9% розчину хлориду натрію у співвідношенні 1:9 (вага:об'єм). Стан мембран лізосом пігментного епітелію оцінювали опосередковано за зміною рівня активності неседиментуючої та загальної кислої фосфатази в сітківці експериментальних тварин (Покровский А.А. із співавт., 1976).
В сітківці досліджуваних тварин спектрофотометрично визначали вміст тіолової і дисульфідної форм глютатіону, глюкозо-6-фосфату, НАДФ, НАДФН, активність загальної та неседиментуючої кислої фосфатази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, глютатіонредуктази, глютатіонпероксидази, глютатіон-S-трансферази, ?-глутамілтранс-пептидази.
2.2. Методи біохімічного аналізу і препарати, що використовувались у роботі.
2.2.1. Принцип методу визначення вмісту тіолової форми глютатіону.
У результаті реакції між глютатіоном і метилгліоксалем в присутності ферменту гліоксилази відбувається утворення кон'югату S-лактоїлглютатіону, що має максимум поглинання при довжині хвилі 240 нм.
Хід виконання: для визначення вмісту тіолової форми глютатіону до кювету послідовно додавали 0,5 мл нейтралізованого екстракту, 0,15 мл 1% розчину яєчного альбуміну і 0,01 мл суспензії гліоксилази (0,6 Од/мл в кюветі). Вимірювали оптичну щільність розчину Е1. Додавали 0,02 мл 0,1 М розчину метилгліоксалю і перемішували. Після закінчення реакції реєстрували Е2. До кювету вносили вдруге 0,02 мл 0,1 М розчину метилгліоксалю, реєструючи оптичну щільність розчину Е3.
Для вимірювань використовували спектрофотометр СФ-26 і довжину хвилі 240 нм. Середнє значення коефіцієнта варіації для тіолової форми - 4%.
Отримані результати використовували для розрахунку вмісту тіолової форми глютатіону за формулою:
С = ?Е·V·P·K/?·d·v, де
С - вміст тіолової форми глютатіону;
?Е = Е2-Е1-(Е3-Е2) - різниця оптичної щільності розчину до (Е1) і після закінчення реакції (Е2), а також визначення впливу додавання розчину метилгліоксалю на оптичну щільність розчину в кюветі (Е3-Е2);
V - загальний об'єм в кюветі в мл;
P - фактор розведення екстракту перед аналізом;
? - молярний коефіцієнт для S-лактоїл-глютатіону 3,37 при довжині хвилі 240 нм;
d - товщина кювети 1 см;
v - об'єм досліджуваного нейтрального екстракту, взятого для аналізу в мл;
K - коефіцієнт розведення тканинного екстракту при приготуванні кислого і нейтрального екстрактів і перерахунку на 1 г сітківки або 1 л крові.
Вміст глютатіону виражали в мкмоль/г сітківки і мкмоль/л крові [118].
2.2.2. Принцип методу визначення дисульфідної форми глютатіону оснований на тому, що в результаті ферментативного відновлення глютатіону глютатіонредуктазою відбувається окислення НАДФН, зменшення вмісту якого реєструється спектрофотометрично при довжині хвилі 340 нм.
Хід виконання: після закінчення визначення вмісту тіолової форми глютатіону до тієї ж кювети додавали 0,1 мл 11 мМ розчину НАДФН. Перемішували і реєстрували оптичну щільність (Е4) при довжині хвилі 340 нм. Додавали 0,01 мл суспензії глютатіон-редуктази (0,018 Од/мл реакційного розчину) і реєстрували оптичну щільність розчину після