РАЗДЕЛ 2
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
Для исследования дигидропиридин-чувствительности эндогенных и клонированных кальциевых каналов Т-типа применялись следующие экспериментальные подходы:
1. метод приготовления изолированных нейронов ЛДЯ таламуса крысы;
2. метод выделения ооцитов Xenopus laevis и экспрессирования мРНК пороформирующих канальных субъединиц в модельных системах
3. метод внутриклеточной фиксации потенциала на нейроне в конфигурации "целая клетка"
4. метод двухэлектродной фиксации потенциала
5. математические методики обработки результатов
2.1 Таламические нейроны
Все нейроны таламуса морфологически можно разделить на три основных типа: таламокортикальные релейные нейроны, вставочные нейроны и ретикулярные таламические нейроны [184]. Подавляющее большинство таламокортикальных нейронов (85-90%) среднего или большого размера (площадь сомы 300-400 мкм2).
Рис. 2.1. Типы таламических нейронов и связи между ними. Т-К - таламокортикальный нейрон, И - интернейрон, Р - ретикулярный нейрон, Спец. афф. - специфическоее растущее афферентное волокно, К - кортикальный нейрон, Г - гломерула.
Быстропроводящие аксоны этих нейронов расходятся радиально и проецируются в средние и глубокие слои коры. Остальные 10-15% таламокортикальных клеток примерно в два раза меньше по размеру по сравнению с первой группой, и их медленнопроводящие аксоны посылают проекции в поверхностные слои коры. Интернейроны (вставочные нейроны) имеют сому сферической или овальной формы площадью около 200 мкм2, а аксоны и дендриты этих нейронов ветвятся локально. Ретикулярные таламические нейроны характеризуются сомой среднего и большого размера (300-400 мкм2). Несколько утолщенные первичные дендриты этих клеток дают начало вторичным крошечным веточкам, которые покрыты длинными нитеобразными отростками. Ретикулярные нейроны проецируются в другие таламические ядра и получают афферентные волокна от нейронов коры и таламуса [184].
В латеральных ассоциативных ядрах присутствуют три типа нейронов. Первый тип представлен релейными таламокортикальными нейронами - мультиполярными клетками размером до 20 мкм, с 4-6 дендритами. Первичное деление дендритов происходит на расстоянии 15-30 мкм от тела клетки. Дендриты третьего порядка длиной около 70 мкм обычно больше не делятся и заканчиваются терминалями. Таким образом, дендритное поле нейрона, имеет диаметр около 170 мкм. У 40% таких нейронов дендриты и аксоны отходят от противоположных полюсов тела клетки. Аксоны, направляющиеся из ядра рострально, обычно тонкие и не превышают по диаметру 2 мкм. Ко второму типу относятся веретенообразные клетки размером 10х15 мкм, которые являются подтипом релейных нейронов. Дендриты этих клеток дают вторичные ветви на расстоянии 20 мкм от тела клетки. Дендритное поле нейрона составляет 200 мкм в диаметре. Третий тип клеток (интернейроны) - мелкие нейроны, сходные по строению с клетками II типа Гольджи, составляют 20% клеток ядра [163].
2.1.1 Получение изолированных таламических нейронов
Для экспериментов использовались животные в возрасте 14-17 дней. Животное наркотизировали эфиром, потом проводили декапитацию. Мозг вместе с черепной коробкой быстро переносили в охлажденный раствор №2 (+5С?) з таким составом (ммоль/л): NaCl-150, KCl-5, CaCl2-0,9, MgCl2-1,1, NaHCO3 -26, NaH2PO4-1,25, Глюкоза -10, рН доводили раствором NаОН до 7,4.
Полушария мозга разделялись и делались сагиттальные срезы толщиной приблизительно 300 мкм с помощью тонкого лезвия. Согласно стереотаксическому атласу были выбраны слайсы, содержашие нейроны ЛДЯ [176]. Слайсы помещали в раствор №1 для инкубации с таким составом (ммоль/л): NaCl-150, KCl-5, CaCl2-2, MgCl2 -2, NaHCO3-26, NaH2PO4-1,25, Глюкоза -10, который постоянно насыщался карбогненом (газовой смесью О2 (95%) та СО2(5%)) для поддержанияя рН на уровне 7,35-7,4. Время с момента декапитации животного до перенесения слайсов в преинкубационную камеру не должен был превышать 4-6 минут. После завершения процесса инкубации, слайсы подвергали ферментативной обработке: в растворе №2 растворяли фермент протеазу ( Sigma, тип ХХІІІ ) до концентрации 2мг/мл. Слайсы из инкубационнойї камеры переносили в этот протеолитический раствор и ставили на водяную баню на 20 минут при Т=32С0. Раствор постоянно насыщали карбогеном. После ферментативной обработки слайсы выдерживали в безферментном растворе около 20 минут, чтобы остастановить действие фермента. Конечной стадией процесса было перенесение слайсов в раствор №2, где они хранились при комнатной температуре на протяжении 4-6 часов, при безперерывном поступлении карбогена .
Для получения изолированних клеток слайсы переносили в раствор №3 следующего состава (ммоль/л): NaCl -130, KCl-5, CaCl2-3, MgCl2-2, HEPES-10, глюкоза-10, рН доводили раствором NаОН до 7,4. Путем пропускания ткани срезов через пипетки с разными диаметрами кончиков получали суспензию клеток, которую помещали позже в измерительную камеру.
2.2 Система трансляции в ооцитах - универсальный инструмент исследования канальных белков
Быстрое развитие молекулярной биологии и вслед за ней молекулярной генетики и иммунохимии способствовало появлению работ по выделению, очистке, расшифровке аминокислотной последовательности канальных белковых молекул, определению их субъединичного состава и реконструированию подобных молекул в исскуственную мембрану [22,26,39,67]. Применение метода клонирования кДНК (комплиментарной ДНК) и ее экспрессии в зукариотических клетках определило следующий этап в области исследований ионных каналов. Основное преимущество данного метода заключается в возможности синтеза в большом количестве необходимых полипептидов, что позволяет получать и использовать для последующего анализа редкие или встречающиеся в незначительном количестве белки, в том числе и белки канальных молекул. В результате появилась возможность изучать биогенез кальциевых каналов(экспрессию генов и ее регуляцию, трансляцию, пострансляционные модификации, встраивание
- Київ+380960830922