РОЗДІЛ 2
Інтерферон-індукована система 2?,5?-олігоаденілату
2.1. Загальні риси системи 2?,5?-олігоаденілату
Система 2?,5?-олігоаденілату являє собою метаболічний шлях деградації РНК у клітинах вищих хребетних (рис. 2.1). Вона індукується ІФН і залучена в реалізації його ефектів: антивірусного захисту, регуляції росту та диференціації клітин, онкогенної стабільності, реакції на зміну гормонального статусу, процесах апоптозу, розвитку теплового шоку та різних патологічних станів [3, 155].
Рис. 2.1. Схема метаболічного шляху деградації РНК за участю системи 2?,5?-олігоаденілату [155]
ІФН-залежна відповідь 2?,5?-олігоаденілату, що призводить до гідролізу РНК, потребує участі двох ферментів - 2?,5?-олігоаденілат-синтетази (2?,5?-OAS) та РНК-ази L. Обидва типи ІФН активують експресію 4 генів дсРНК-залежної 2?,5?-OAS, локалізованих у людини в 12-й хромосомі. Остання синтезує з АТР 2?,5?-олігоаденілати (2-5А) загальної структури ppp(A2?p)n5?A. Активність ферменту проявляється лише в присутності дсРНК довжиною щонайменше 30 п.н., яка найчастіше є продуктом життєдіяльності вірусу. В свою чергу 2?,5?-олігоаденілати взаємодіють з латентною клітинною ендонуклеазою РНК-азою L, внаслідок чого остання димеризується, переходячи в активну форму. Активована РНК-аза L ефективно розщеплює як вірусні, так і клітинні одноланцюгові РНК (рРНК або тРНК) з 3?-кінця, завдяки чому запобігає зчитуванню чужорідної генетичної інформації, пригнічуючи синтез білка та вірусний ріст [80, 155]. У клітинах ссавців існує базальний рівень 2?,5?-OAS та РНК-ази L, проте їх активність суттєво зростає при дії ІФН [3, 4, 74, 75].
Третій необхідний фермент, що також приймає участь у метаболізмі та дії 2-5A, - 2?-фосфодіестераза, яка каталізує гідролітичне розщеплення 2?,5?-фосфодіефірних зв'язків, викликаючи таким чином затухання відповіді 2-5A та здійснюючи зворотну регуляцію системи ІФН. Під дією ІФН рівень цього ферменту у цитоплазмі зростає майже в 5 разів, перешкоджаючи нагромадженню олігоаденілату. Таким чином, внаслідок взаємодії позитивного й негативного факторів рівень 2-5А носить динамічний характер, що дозволяє захистити клітинні РНК від деградації під дією РНК-ази L [11].
2.2. 2?,5?-олігоаденілат-синтетаза - ключовий фермент системи 2?,5?-олігоаденілату
2?,5?-олігоаденілат-синтетаза (OAS) (АТР: полінуклеотид аденілілтрансфераза, КФ 2.7.7.19.) - один з перших охарактеризованих інтерферон-залежних білків [156], що індукується ІФН як І, так і ІІ типу та є посередником ефектів даного цитокіну. OAS експресуються у вигляді латентних ферментів, для активації яких необхідна дсРНК [157]. Оскільки більшість вірусів продукують дсРНК на певній стадії свого життєвого циклу, вважається, що активатором 2?,5?-OAS в інфікованих клітинах виступає дсРНК вірусного походження. Крім того, OAS приймають участь в індукції апоптозу та контролі клітинного росту [158, 159], а також відіграють важливу роль у злоякісному процесі [81].
Активовані OAS синтезують з АТФ 2?,5?-сполучені олігоаденілати [157]:
АТР + АТР > ppp5'A2'p5'A + PPi.
Подальше нарощування олігонуклеотиду відбувається шляхом перенесення наступного залишку АМР з АТР на ОН-групу кінцевого залишку олігомеру:
(n+1)ATP > ppp5'A(2'p5'A)n + n PPi , 2 ? n ? 10.
Кінетична крива реакції має сигмоподібну форму, що свідчить про наявність кооперативного ефекту. КМ ферменту з клітин асцита Ерліха становить 2 мкМ [160].
2?,5?-OAS може переносити залишки АМР не лише на АТР та 2-5А, а й на інші субстрати: НАД+, AДФ-рибозу. В суміші НАД+ та АТФ домінуючим продуктом є НАД-ppp5'A(2'p5'A)nA; в присутності АТР, АДФ-рибози та А5'ррр5'А утворюються рибозо-pp(A2'p)nA або А5'ррр5'(А2'р)nА. Тому OAS можна визначити як 2?,5?-нуклеотидилтрансферазу, що каталізує утворення ко-олігонуклеотидів [161]. Крім того, виділений з ретикулоцитів фермент приєднував до 2'-ОН-групи олігоаденілату не тільки залишки АМФ, але й ГМФ, УМФ, ЦМФ, ТМФ, дAMФ, дЦМФ тощо [155]. В молекулі OAS представлені два нуклеотид-зв'язувальні сайти, відповідальні за формування 2-5А продукту, - акцепторний і донорний. Донорний сайт зв'язує АТФ, 2-5А, НАД+ та інші АМФ-вмісні нуклеотиди. Акцепторний сайт взаємодіє з АТФ - субстратом для 2?-аденилювання. Кінетичні дослідження встановили наявність сайтів зв'язування високої (Kd = 9 µM) та низької афінності (Kd = 1000µM) [162].
Відомі на сьогодні ізоферменти родини OAS поділяють за розміром на три класи: "великі", "середні" і "малі", кожен з яких включає багато ізоформ [74, 161]. Було показано, що під дією ІФН в клітинах експресуються три види 2?,5?-OAS, які відповідають білкам з молекулярною масою 40/46, 69/71 та 100. "Малі" р40 і р46 форми, позначені OAS1, ідентичні між собою за N-кінцевою ділянкою в 346 амінокислот, але відрізняються за C-кінцевими областями. Вони кодуються транскриптами 1,6 та 1,8 kb відповідно - продуктами альтернативного сплайсингу між 5 і 6 екзонами одного гену [76]. "Середні" форми p69 і p71, позначені OAS2, аналогічно, є продуктами альтернативного сплайсингу одного гену. Вони ідентичні за N-кінцевою послідовністю в 683 амінокислоти, складаються з двох суміжних доменів, кожен з яких гомологічний р40 ізоформі OAS1. Велика 100-кДа ізоформа OAS3 складається з 1087 амінокислот і містить 3 повторювальні ділянки, гомологічні OAS1 [74, 77].
Структурно-функціональні та ензиматичні особливості OAS вивчались в модельних системах з експресією рекомбінантних білків. Відмінність між різними ізоформами OAS полягає у розмірах синтезованих ними продуктів: р69 синтезує 2-5А довжиною до 30 залишків, тоді як р42 - тільки гексамери. За оптимальних умов р69 синтезувала довші олігомери 2-5А, ніж pl00 [74, 163]. Інша відмінність - у ступені олігомеризації різних ізоформ OAS. Методом ізоелектричного фокусування з використанням препаратів р69, мічених S35-цистеїном та Н3-міристатом, та гель-фільтрації було показано існування двох форм р69, які можуть існ