Розділ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Тварини, метеріали та реактиви
Дослідження хронічних ефектів речовин in vivo проведені на 120 білих
щурах-самцях лінії Вістар, средня маса яких становила 175 г. Досліджувані
речовини вводились тваринам щоденно в об’ємі 1 мл інтрагастрально за допомогою
зонду до годування протягом 4-х тижнів. Тварин було поділено на 10 груп: №1 –
контрольна, яка отримувала 1 мл Н2О (дистильована) і дев’ять
експериментальних:
група №2 – 2,4-Д (10 мг/кг маси щоденно),
група №3 – івін (50 мг/кг маси щоденно),
група №4 – 2,4-Д (10 мг/кг) та івін (50 мг/кг маси) одночасно,
група №5 – потейтин (50 мг/кг маси),
група №6 – 2,4-Д (10 мг/кг) та потейтин (50 мг/кг) одночасно,
група №7 – сукцинат натрію (5 мг/кг маси),
група №8 – 2,4-Д (10 мг/кг) та сукцинат натрію (5 мг/кг маси) одночасно,
група №9 – УДХК (2 мг/кг маси),
група №10 – 2,4-Д (10 мг/кг) та УДХК (2 мг/кг маси) одночасно.
Після закінчення терміну затравок усіх тварин декапітували, печінку, середня
маса якої становила 7г, зберігали в рідкому азоті.
Ефекти досліджуваних речовин – гербіциду 2,4-Д та івіну, потейтину, сукцинату
натрію і УДХК in vitro в діапазоні концентрацій 10-9-10-4 М проведені на
фракціях ПМ клітин печінки 53 інтактних щурів самців лінії Wistar, средня маса
яких становила 175 г. Тварин декапітували і використовували печінку, середня
маса якої становила 7 г.
Гербіцид 2,4-Д отримано з Інституту токсикології та екогігієни ім. Л.І. Медведя
МОЗ України, регулятори росту рослин івін і потейтин синтезовані в Інституті
біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.
Інші реактиви кваліфікації х.ч. та ч.д.а., використані в роботі, представлені в
таблиці 2.1. Розчини готувались на дистильованій воді.
Таблиця 2.1
Реактиви та речовини, що використовувалися в роботі
Найменування
Виробник
Країна
KCl, NaCl, NaOH, Na2HPO4, NaH2PO4
Хімлаборреактив
Україна
Трихлороцтова кислота, MgCl2, Na2CO3, CaCl2, NaHCO3
УкрРеаХім
Україна
Сахароза, CH3COONa, NaN3, АТФ, АМФ, глюкозо-6-фосфат, рибофлавін,
N,N,N,N-тетраметилетимендіамін, нітросиній тетразолій
Reanal
Угорщина
ЕДТА, ЕГТА, Уабаїн
Sigma
CША
Трис-гідроксил-метиламінометан
Serva
Німеччина
Оцтова кислота, соляна кислота, гліцерин
Міранда С
Україна
Реагент №1, №2 для АлАТ
Реагент №1, №2 для ГГТ
DiaSys Diagnostic Systems GmbH & Co. KG
Німеччина
2-тіобарбітурова кислота
ORGANICA
Німеччина
Сукцинат натрію
Завод химических реактивов. Ленинград
Росія
Урсодезоксихолева кислота в складі лікарського препарату „Урсофальк”
Фальк
Німеччина
2.2. Визначення активності ферментів
2.2.1. Аланінамінотрансфераза. Фрагмент печінки вагою 2 г подрібнювали в чашці
Петрі на льоду до гомогенного вигляду, гомогенізували в скляному гомогенізаторі
з притертим тефлоновим поршнем 30 разів в 50 мл середовища такого складу: 0,25
М сахароза, 0,025 М Трис-НСl буфер; рН 7,4. Гомогенат фільтрували через 4 шари
марлі для видалення жирових частинок та шматочків сполучної тканини, та
центрифугували 10 хв при 4500 g в центрифузі ОПН-8 7000 об/хв. В супернатанті
визначали білок за методом Лоурі [167], і розводили його вищевказаним буфером
до концентрації білка 7-10 мг/мл. Отриману суспензію використовували для
визначення ферментативної активності гомогенату печінки.
Активність аланінамінотрансферази (АлАТ) визначали за методом Томаса [228] із
застосуванням стандартного набору реагентів (DiaSys Diagnostic Systems GmbH &
Co. KG Німеччина). Визначення активності аланінамінотрансферази полягає у
фотометричному визначенні пірувату – продукту реакції переамінування
L-аланіна.
Для вимірювання активності АлАТ використовували реагент № 3, який складається
із 4-х об’ємів реагента №1: 100 мМ Трис-буфер рН 9,6, 500 мМ L-аланін, 1200 Е/л
лактатдегідрогеназа (1 Е/л=16,67 нмоль/л/с х л), 0,95 г/л NaN3, і 1 об’єму
реагента № 2: 0,18 мМ НАДН, 15 мМ a-кетоглутарат.
В реакційну суміш - 1 мл реагенту № 3, яку протягом 5 хв нагрівали при t 37єС -
вносили 0,1 мл гомогенату. Пробу перемішували та інкубували при t 37єС протягом
1 хв, після чого проводили вимірювання оптичної щільності проби (Е1) при
довжині хвилі 340 нм. Через 1 хв проводили повторне вимірювання оптичної
щільності (Е2).
Активність АлАТ визначали за різницею між двома оптичними щільностями (Е2-Е1),
і виражали в ммоль продукту (піруват) на мг білка за хвилину.
2.2.2. Гама-глутамілтрансфераза. Визначення активності
гамма-глютамілтрансферази (ГГТ) проводили за методом [227] з використанням
стандартного набору реагентів (DiaSys Diagnostic Systems GmbH & Co. KG
Німеччина) у гомогенаті печінки, який готували як описано вище (див. гл. 2.2).
Активність гамма-глутамілтрансферази визначали за продуктом її реакції –
4-аміно-2-нітробензоатом, який поглинає світло при 405 нм. Збільшення
поглинання при цій довжини хвилі прямо пропорційно активності ГГТ.
У проби вносили 0,1 мл досліджуваного гомогенату, 1 мл реагенту № 1 такого
складу: 100 мМ Трис-буфер, рН 8,3 та 100 мМ гліцилгліцин, реакційну суміш
перемішували, інкубували при 37єС. Потім додавали 250 мкл реагенту № 2 – 4 мМ
L-гамма-глутаміл-3-карбокси-4-нітроанілід, перемішували і вимірювали оптичну
щільність реакційної суміші через 1, 2 і 3 хв.
Активність ГГТ розраховували в ммоль продукту (4-аміно-2-нітробензоат) на мг
білка за хвилину.
2.2.3. Супероксиддисмутаза. Наважку тканин печінки (800 мг) подрібнювали в
чашці Петрі на льоду до гомогенного вигляду і гомогенізували в скляному
гомогенізаторі з притертим тефлоновим поршнем 30-ма ходами поршня в 4 мл 10 мМ
Трис-НСl буфера (рН 7,4) (співвідношення тканини до буферу – 1:5).
У фракції, яку отримували центрифугуванням гомогенату протягом 30 хв при 8000
об/хв (5000 g) [17] виз
- Київ+380960830922