ГЛАВА 2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект и условия эксперимента
В экспериментах были использованы крысы самцы линии Вистар разного возраста,
которые содержались в стандартных условиях вивария и находились на стандартном
режиме кормления. При работе соблюдали этические принципы экспериментальных
исследований и с учетом положений “Правила проведения работ с использованием
экспериментальных животных“ [М. Zimmermann, 1983].
2.1.1. Экспериментальная модель иммобилизационного стресса
В работе было использовано 270 крыс. Животные делились на пять возрастных
групп:
1 – 1,5-месячные (масса 80 - 90 г);
2 – 2-месячные (масса 100 - 120 г),
3 – 6-месячные (масса 200 - 260 г),
4 – 12-месячные (масса 260 - 300 г),
5 – 24-месячные (масса 360 - 450 г).
Каждая группа, в свою очередь делилась на 2 подгруппы:
1 – интактные животные;
2 – крысы, подвергнутые иммобилизационному стрессу.
Для воспроизведения иммобилизационного стресса крыс фиксировали за конечности
спиной к неподвижной опоре. Экспозиция - 30 минут. После этого крыс немедленно
подвергали декапитации под легким эфирным наркозом.
Эффективность воспроизведения иммобилизационного стресса контролировали путем
определения концентрации 11-оксикортикостероидов, адреналина и
карбонилированных белков в сыворотке крови.
В специальном эксперименте с целью коррекции изменений со стороны
свободнорадикальных процессов в тканях внутренних органов крыс, подвергнутых
30-минутной иммобилизации, животным перед иммобилизацией вводили новый
перспективный антиоксидантный препарат - экстракт аронии [О.И. Ипатова, В.Н.
Прозоровский, 2000]. Препарат очищенного сухого экстракта аронии был получен из
Государственного учреждения научно-исследовательский институт биомедицинской
химии им. В.Н. Ореховича (г. Москва).
Экстракт аронии разводили физиологическим раствором хлористого натрия и вводили
внутрибрюшинно в дозе 0,2 г / кг массы тела животного за 60 минут до начала
иммобилизации.
2.2. Подготовка проб и субклеточное фракционирование
Кровь собирали в сухие центрифужные пробирки и центрифугировали 15 мин при 3000
об/мин. Сыворотку переносили в отдельные пробирки и использовали в дальнейших
исследованиях.
После декапитации животного немедленно вскрывали брюшную полость и
перфузировали печень охлажденным физиологическим раствором. Печень и бедренную
мышцу помещали в жидкий азот. Для определения концентрации продуктов
свободнорадикального окисления липидов и белков навески замороженной ткани
подвергали экстракции в соответствии с процедурами, описанными в разделе 2.3.
Для определения активности ферментов катаболизма альдегидов ткань печени и
бедренной мышцы подвергали дальнейшему гомогенизированию и субклеточному
фракционированию (рис.2.1).
1 г ткани + 10 мл среды выделения (1:10)
гомогенизирование
гомогенат
Ѕ фильтрование через
2 слоя марли
фильтрат
центрифугирование (10 мин - 3000 g)
супернатант осадок
центрифугирование (20 мин - 10000 g)
супернатант осадок
(постмитохондриальная (суспензирование с 5 мл
фракция) среды выделения)
центрифугирование (20мин - 10000 g)
супернатант осадок
(суспензирование с 1 мл среды выделения)
(митохондриальная
фракция)
Рис. 2.1. Схема фракционирования гомогенатов печени и бедренной мышцы.
Для получения субклеточных фракций тканей извлеченные печень и бедренную мышцу
немедленно помещали в охлажденный до 40 С изотонический раствор хлористого
натрия и тщательно отмывали от крови. После этого ткань промокали на марлевой
салфетке, делали навеску на торсионных весах и тщательно измельчали ножницами.
Ткань печени гомогенизировали в среде выделения, содержащей 0,25 М сахарозы и
0,01 М ТРИС (рН 7,4) в соотношении 1 : 10 (масса ткани : объем среды выделения)
в стеклянном гомогенизаторе Поттера – Эльвегейна. Мышечную ткань
гомогенизировали в среде выделения, содержащей 0,25 М сахарозы и 0,01 М ТРИС
(рН 7,4) в соотношении 1 : 3 (масса ткани : объем среды выделения).
Приготовленные гомогенаты фильтровали через 2 слоя марли и центрифугировали при
3000 g в течение 10 минут. Надосадочную жидкость подвергали центрифугированию
при 10000 g в течение 20 мин. Полученную при этом надосадочную жидкость
использовали в работе в качестве постмитохондриальной фракции, а осадок после
суспензирования в среде выделения и подвергали повторному центрифугированию в
аналогичных условиях. Отмытый таким образом осадок использовали в исследованиях
в качестве грубой митохондриальной фракции. Все процедуры выделения проводили
при 4оС.
Пробы митохондриальной и постмитохондриальной фракции печени и бедренной мышцы
до исследований хранили в замороженном состоянии.
2.3. Оценка интенсивности свободнорадикальных процессов
Для оценки состояния свободнорадикальных процессов в печени и бедренной мышце
измеряли содержание продуктов свободнорадикального окисления липидов (диеновые
конъюгаты и шиффовые основания) и белков (карбонилированные белки).
0,5 г замороженной в жидком азоте ткани (печень, бедренная мышца)
гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма с 5 мл смеси
растворителей (гептан : изопропиловый спирт) в соотношении 1 : 1. Гомогенат
выдерживали в течение 15 минут при комнатной температуре до полного разделения
фаз. После этого к пробе добавляли 0,5 мл дистиллированно
- Київ+380960830922