РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Реагенти та матеріали
У роботі було використано такі реактиви та матеріали:
N-гідроксисукцинімідобіотин, авідин, авідин-алкалін фосфатаза,
п-нітрофенілфосфат (p-NPP), еластаза, б-казеїн („Sigma”, США), контрикал
(„AWD”, Німеччина), тромбін („Immuno”, Австрія), стрептокіназа (Kabikinase,
„Pharmacia”, Швеция), тканинний активатор плазміногену (Genentech, США),
трис(гідроксиметил)амінометан, діізопропілфторфосфат („Merck”, Германия),
специфічний хромогенний субстрат плазміну S2251
(H-D-Val-L-Leu-L-Lys-p-нітроаніліну гідрохлорид) („Chromogenix”, Швеція),
специфічний хромогенний субстрат тканинного активатора плазміногена
Chromozym-tPA (N-мeтилсульфоніл-D-Phe-Gly-Arg-p-нітроанілід) („Roshe”, США),
альбумін бичачої сироватки („USB”, Канада), маркери молекулярной маси
(Molecular Weight Calibration Kits – LMW, 94,000 – 14,400, „Amersham
Biosciences AB”, США; 116,000 – 14,400, „Fermentas”, Литва), лізин-сефароза,
активована бромціаном сефароза 4В, сефадекси G-75, G-100, G-150, G-200,
КМ-сефадекс, супероза 12 HR, mono Q, сефакрил S-300 („Amersham Biosciences AB”,
Швеція). Неорганічні сполуки ступеню чистоти хч або вище вітчизняного
виробника. Планшети для імуноферментного аналізу („Costаr”, США, „Nunc”, США).
2.2. Одержання Glu-плазміногену
Glu-форму Пг людини одержували з цитратної плазми донорської крові людини
методом афінної хроматографії на лізин-сефарозі за присутності інгібітора
протеїназ (Контрикал, „AWD”, Німеччина) [129]. Для інактивації домішок плазміну
білок обробляли протягом 2 год при +25 °С інгібітором серинових протеїназ
– діізопропілфторфосфатом до кінцевої концентрації 0,005 М.
Пг гель-фільтрували на сефадексі G-150, що був попередньо врівноважениий 0,1 М
гідрокарбонатом амонію, для видалення високо- і низькомолекулярних домішок та
інгібітора. Всі етапи проводили при +4 °С для запобігання перетворенню Glu-Пг
на Lys-форму. Препарат ліофілізували і зберігали при +4 °С.
Препарати Пг мали потенційну протеолітичну активність 19-22 казеїнолітичні
одиниці (к.о.) на 1 мг білка. Спонтанна активність не виявлялась ні
казеїнолітичним методом, ні при гидролізі хромогенного субстрату S2251. Чистоту
одержаних препаратів контролювали за допомогою електрофорезу в 10 % ПААГ с
DS-Na та в 11,5 % ПААГ з оцтовою кислотою і сечовиною при рН 3,2 (Рис. 2.1.).
Рис. 2.1. Електрофореграми препаратів плазміногену:
А - 1 - Glu-Пг; 3 - білкові маркери в 10% ПААГ с DS-Nа;
Б - 1 - Glu-Пг, 2 - Lys-Пг, який взято в якості контролю, в 11,5% ПААГ з
оцтовою кислотою і сечовиною при рН 3,2.
2.3. Виділення фрагментів плазміногену
Для одержання міні-Пг, кринглів К 1-3 та К 4 проводили еластазний гідроліз Пг
панкреатичною еластазою свині за співвідношення еластаза : Пг (маса/маса) 1 :
50 в 0,05 М трис-НСl-буфері (рН 8,5), що містив 0,1 М NaCl, протягом 7 год при
+25 0С. Реакцію гідролізу зупиняли додаванням п-нітрофенілгуанідинбензоату до
кінцевої концентрації 1•10-4 М. Проводили гель-хроматографію гідролізату на
сефадексі G-75 із наступною хроматографією на лізин-сефарозі [67].
Для одержання мікро-Пг проводили гідроліз проферменту за співвідношення Пм:Пг
(маса/маса) 1:10 в 0,1 М гліцин-НСl-буфері (рН 10,5) протягом 24 год при +25
0С. Гідролізат послідовно пропускали через дві колонки – з іммобілізованими на
активованій бромціаном сефарозі 4В лізином та соєвим інгібітором трипсину,
після чого наносили на колонку mono Q. Білок елюювали за градієнтом рН 9,3-7,1
[68].
Препарати кринглів 1-3, крингла 4 и міні- та мікро-Пг зберігали при -20 °С
протягом 6 місяців.
Потенціальна протеолітична активність одержаних препаратів міні- та мікро-Пг
складала 15-20 казеїнолітичних одиниць (к.о.) на 1 мг білка. Спонтанна
активність не виявлялась ні казеїнолітичним методом, ні при гідролізі субстрату
S2251.
Чистоту одержаних препаратів контролювали за допомогою електрофорезу в 10 %
ПААГ с DS-Na. Крингли 1-3, крингл 4 и міні- та мікро-Пг були електрофоретично
гомогенні (Рис.2.2.).
Рис. 2.2. Електрофореграма фрагментів плазміногену в 10 % ПААГ с DS-Nа: 1 –
білкові маркери; 2 – крингли 1-3; 3 – міні-плазміноген; 4 – крингл 4.
2.4. Одержання плазміну, міні- та мікро-плазміну
Плазмін, міні- та мікро-плазмін одержували активацією відповідних проферментів
урокіназою, що іммобілізована на активованій бромціаном сефарозі 4В [130]. 1 мг
Пг, міні- або мікро-Пг інкубували з 0,5 мл гелю урокіназ-сефарози (1250 МО/мл)
протягом 1 годи при +37 0С в 0,05 М натрій фосфатному буфері, pH 7,4, що містив
25 % гліцеролу. За таких умов ступінь перетворення проферменту в фермент
складає не менше 95 %.
Ефективність активації оцінювали за швидкістю гідролізу хромогенного субстрату
S2251 та даними електрофорезу з DS-Na в ПААГ за присутності 2 %
b-меркаптоетанолу.
Препарати зберігали в 0,05 М натрій фосфатному буфері, pH 7,4, що містив 50 %
гліцерол (по об’єму), при -10 0С.
2.5. Одержання фібриногену
Фібриноген виділяли з оксалатної плазми бика [131]. Для одержання фібриногену
без домішок плазміногену його обробляли розчином лізину з наступним спиртовим
переосадженням [132]. Для виснаження фібриногену на фактор XIII використовували
п-хлормеркурійбензоат (п-ХМБ)-сефарозу [133]. Препарат зберігали при -20 0С.
Вміст фібриногену, що зсідався під дією тромбіну, в одержаних препаратах
складав 95-98 %.
2.6. Одержання desАA- та desАABBфібрину
ДезААВВфібрин, вільний на плазміноген, одержували активацією фібриногену
тромбіном за присутності 0,05 М 6-АГК [134]. Для інактивації активованого
фактор