Розділ 2
Матеріали та методи досліджень
2.1. Методичні підходи
В роботі здійснено комплексний методичний підхід з використанням фізіологічних,
біохімічних, біофізичних та молекулярно-генетичних методів. Утворення МП
досліджували in vitro в суспензії мітохондрій, ізольованих з серця дорослих і
старих щурів, та в ізольованому серці, що дозволило адекватно і двосторонньо
оцінити зміни чутливості МП при старінні. Дослідження функціональних змін серця
та вивільнення МФ за умов ішемії-реперфузії проводили на моделі ізольованого за
Лангендорфом серця. Дослідження чутливості мітохондрій серця до індукторів МП
та їх взаємодія з інгібіторами МП проводили в суспензії ізольованих мітохондрій
серця щурів та в культивованих живих клітинах фібробластів людини. Для
порівняння рівня експресії мРНК гену bax в міокарді застосовували метод
полімеразної ланцюгової реакції у варіанті зворотної транскрипції. Для вивчення
показників вільнорадикальних процесів та активності NO-синтаз використовували
стандартні біохімічні методики.
2.2. Експериментальні тварини
В експериментах використовували білих щурів-самців лінії Вістар віком 5-6 міс.
вагою 200–250 г (дорослі) та 24-27 міс. вагою 350-400 г (старі). Тварин
утримували на стандартному раціоні віварію Інституту фізіології ім. О.О.
Богомольця НАН України. В експериментах дотримані всі вимоги щодо роботи з
лабораторними тваринами. Експериментальна частина, представлена в роботі,
виконана на 238 тваринах, з яких 107 дорослих і 131 старих щурів. Кількість
тварин, використаних у кожній експериментальній серії, вказана в дужках після
підписів під відповідними рисунками.
2.3. Протокол досліджень
І етап. В експериментах на ізольованому за Лангендорфом серці тварин поділено
на 5 груп (рис.2.1). Усього використано 41 тварина: 18 – дорослих і 23 – старих
щурів.
Рис.2.1. Експериментальний протокол досліджень на ізольованому за Лангендорфом
серці. Описання в тексті. Стрілками ( ) вказано момент відбору проб на
наявність в них мітохондріального фактора; стрілками ( )
позначено момент відбору матеріалу на вивчення експресії м-РНК bax; стрілками (
) позначено момент реєстрації показників ізольованого серця дорослих і старих
щурів за умов ішемії-реперфузії.
Групи І, ІІ – Вплив ішемії-реперфузії на зміни скоротливої функції серця,
відкриття МП і рівня експресії м-РНК bax в серці дорослих (n=11) і старих
(n=11) щурів. Групи III, IV – Вплив перфузії мелатоніном на скоротливу функцію
серця і відкриття МП в серці дорослих (n=7) і старих (n=7) щурів. Групa V –
Вплив курсового введення мелатоніна на скоротливу функцію серця і експресію
м-РНК bax в серці старих щурів (n=5).
ІІ етап. В дослідах на ізольованих мітохондріях проводили наступні серії
експериментів. Усього використано 164 тварин, з яких 78 – дорослих і 86 –
старих щурів. І – Порівняльне дослідження набухання мітохондрій серця дорослих
(n=50) і старих щурів (n=50) за умов дії різних концентрацій ФАО (в діапазоні
концентрацій 10-7-10-4 моль/л); Са2+ (в діапазоні концентрацій 10-7-10-3
моль/л) і t-BuOOH (в діапазоні концентрацій 10-8-10-3 моль/л). ІІ - Порівняльне
дослідження вивільнення МФ з мітохондрій серця дорослих (n=12) і старих щурів
(n=12) за умов дії різних концентрацій ФАО і Са2+. ІІІ – Порівняльне
дослідження набухання мітохондрій серця дорослих (n=28) і старих щурів (n=24)
за умов попередньої їх інкубації з різними концентраціями блокатора активності
NOS - L-NAME (в діапазоні концентрацій 10-7-10-3 моль/л), донором NO,
нітропрусидом натрію (НП-Na). IV – Дослідження ФАО-індукованого набухання
мітохондрій і ФАО-індукованого вивільнення мітохондріального фактора з
мітохондрій серця старих щурів після ІГТ (n=6). V - Дослідження
ФАО-індукованого та Са2+-індукованого набухання мітохондрій серця старих щурів
після курсового введення їм мелатоніна (n=12).
ІІІ етап. Біохімічні дослідження вільнорадикальних процесів і активності
NO-синтаз в гомогенатах тканин та в суспензії ізольованих мітохондрій серця.
Усього використано 33 тварини, з яких 11 – дорослих і 22 – старих щурів. І –
Визначення вмісту пероксиду водню, супероксидного радикалу, дієнових
кон’югатів, активності сNOS та іNOS в мітохондріях серця дорослих (n=5), старих
(n=5) і старих щурів після курсу мелатонінa (n=5). ІІ - Визначення вмісту
пероксиду водню, гідроксильного та супероксидного радикалів в гомогенатах серця
дорослих (n=6), старих (n=6) і старих щурів після ІГТ (n=6).
2.4. Реєстрація показників скоротливої функції ізольованого серця щурів
Експериментальних тварин наркотизували за допомогою уретану (Sigma, 120
мг/кг). Серце, вилучене шляхом розтину грудної порожнини, одразу поміщали в
охолоджений розчин Кребса-Хензеляйта (ммоль/л: NaCl- 118; KCl- 4,7; MgSO4- 1,2;
NaHCO3- 24; KH2PO4- 1,2; глюкоза- 10; СаCl2- 2,5; pH 7,4) і витримували до
повної його зупинки. Потім серце підвішували за аорту до металевої канюлі за
допомогою лігатур та ретроградно перфузували за класичним методом Лангендорфа
[106] розчином Кребса-Хензеляйта (t=370C) при постійному перфузійному тиску.
Після 20-хвилинного періоду стабілізації серця, що означало встановлення
рівноваги параметрів, що реєстрували, проводили 30-хвилинну ішемію шляхом
повного перекривання перфузійного потоку з наступною реперфузією впродовж 40
хв. Про стан скоротливої функції міокарду судили за змінами значень тиску, що
розвиває лівий шлуночок (ТРЛШ), максимальної швидкості його приросту та спаду
(dP/dtmax i dP/dtmin). Для порівняння значень обох вікових груп зміну ТРЛШ,
dP/dtmax і dP/dtmin, які реєстрували в мм рт.ст і мм рт.ст.хсе