РОЗДІЛ 2
Матеріали і методи досліджень
2.1. Мікробні культури залізовідновлювальних бактерій
2.1.1. П р и г о т у в а н н я н а к о п и ч у в а л ь н и х к у л ь т у р З В
Б
2.1.1.1. Приготування накопичувальних культур ЗВБ для експериментів по очищенню
сульфатвмісних стічних вод та видаленню фосфату із концентрованих стічних вод.
Усі накопичувальні культури ЗВБ отримували в анаеробній камері Bacton
Anaerobic/Environmental Chamber (Sheldon Manufacturing, Inc., Cornelius, OR,
USA), що була заповнена наступною сумішшю газів, об/об: N2, 95%; H2, 2,5%; CO2,
2,5%. Для отримання накопичувальної культури ЗВБ в даних експериментах
використовували середовище, яке рекомендовано для вирощування бактерій роду
Geobacter, із списку середовищ Німецької Колекції Мікроорганізмів (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (www.dsmz.com.de). До
складу середовища входили такі компоненти, г/л: NaHCO3 – 2,5; NH4Cl – 1,50;
NaH2PO4 – 0,60; KCl – 0,10; дріжджовий екстракт – 0,05%. Цитрат тривалентного
заліза (C6H8O7Fe) вносили в середовище як джерело заліза до створення
концентрації 20 мМ. До 1 л середовища додавали етанол у кількості 1г ХСК як
джерело вуглецю, а також 10 мл розчину мікроелементів та 10 мл розчину
вітамінів [48, 118].
Розчин мікроелементів включав, г/л: нітрілотриоцтова кислота –1,5; MgSO4·7H2O –
3,0; MnSO4·2H2O – 0,5; NaCl – 1,0; FeSO4·7H2O – 0,1; CoSO4·7H2O – 0,18;
CaCl2·2H2O – 0,1; ZnSO4·7H2O – 0,18; CuSO4·5H2O – 0,01; KAl(SO4)2·12H2O – 0,02;
H3BO3 – 0,01; Na2MoO4·2H2O – 0,01; NiCl2·6H2O – 0,025; Na2SeO3·5H2O – 0,0003;
дистильована вода 1000 мл. При приготуванні розчину спочатку розчиняли
нітрілотриоцтову кислоту, доводили рН до 6,5 за допомогою 1N розчину KOH, а
потім вносили мінеральні компоненти. Кінцеве значення рН доводили до 7,0 1N
розчином КОН . Розчин вітамінів включав, мг/л: біотин - 2,0; фолієва кислота –
2,0; піридоксин - HCl – 10,0; тіамін -HCl 2 H2O – 5,0; нікотинова кислота –
5,0; D-Ca-пантотенат – 5,0; вітамін В12 – 0,1; p-амінобензойна кислота – 50;
ліпоєва кислота – 5,0; дистильована вода - до 1000 мл. Для попередження росту
мікроскопічних грибів у накопичувальній культурі додавали циклогексамід (Sigma,
USA) до кінцевої концентрації 0,01 % . Анаеробний мул активізували витримкою
протягом трьох діб у вищеописаному середовищі з етанолом і використовували як
засівний матеріал у кількості 5 % (об/об).
2.1.1.2. Приготування накопичувальних культур ЗВБ для експериментів по
видаленню фосфату з рідинної фракції анаеробного мулу (РФАМ). Для виготовлення
накопичувальної культури 1 (НК1), 213 мл РФАМ, 12 мл суспензії Fe(OH)3 та 25 мл
бактеріальної суспензії перемішували у пляшці об’ємом 500 мл, що була закрита
та захищена від світа. Культивування проводили на качалці при 120 об/хв та 27оС
протягом 12 діб. Для виготовлення більш специфічної другої накопичувальної
культури (НК2), 180 мл РФАР, 30 мл НК1, та 10 мл суспензії Fe(OH)3 перемішували
у пляшці об’ємом 500 мл, яка була закрита та захищена від світу. Культивування
проводили на качалці при 120 об/хв та 27оС протягом 10 діб.
Підрахунок клітин залізовідновлювальних бактерій у накопичувальній культурі
проводили методом граничних розведень (MГР). До РФАР додавали 1% суспензію
Fe(OH)3 та стерилізували при 121oC протягом 15 хвилин. Готували 10-кратні
розведення зразків у цій стерильній рідині у трьох повторностях у стерильних
пробірках об‘ємом 1,5 мл, які потім інкубували в анаеробній камері протягом 10
діб. Наявність росту ЗВБ визначали фенантроліновим методом за присутністю
Fe(II) у середовищі .
2.1.2. В и д і л е н н я ч и с т о ї к у л ь т у р и З В Б. Мікробіологічне
виділення проводили із 10-кратних розведень накопичувальної культури НК2 в 0,9
мл фосфатного буферу з pH 7.2. Для приготування твердого середовища для
виділення ЗВБ, 25 г бактеріального агару (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)
додавали до 1 л рідинної фракції анаеробного реактора. Середовище стерилізували
протягом 15 хвилин при 121oC. Чашки Петрі інкубували після посіву при кімнатній
температурі протягом 14 діб в анаеробній камері. Два типа колоній було
відзначено на чашках Петрі. Клітини індивідуальних колоній переносили на свіже
середовище для зберігання та визначення здатності до відновлення Fe(III).
2.2. Джерела заліза
Гідроксид заліза готували повільним додаванням 2 M NaOH до 250 мМ розчину
FeCl3; утворений осад промивали 6 разів дистильованою водою до повного
видалення хлору та натру [118].
Природними джерелами заліза слугували глина з вмістом заліза 3 –7 % та залізна
руда з вмістом заліза 65%.
2.3. Апаратурне оформлення
Для дослідження впливу відновлення тривалентного заліза з природних мінералів
на процес очищення модельної жировмисної стічної води використовували
лабораторну установку (рис. 2.1).
Анаеробну обробку модельної стічної води проводили в лабораторних
експериментальних реакторах з робочим об’ємом 250 та 500 мл та магнітною
мішалкою зі швидкістю 100 об/хв. Процес проходив при температурі 35оС. Для
видалення кисню реактори перед початком експерименту продували азотом протягом
5 хвилин.
При вивченні впливу заліза на анаеробну обробку сульфат- та фосфатвмісних
стічних вод анаеробний процес проводили в закритих гумовими пробками пляшках
об’ємом 100 мл на качалці з 150 об/хв при температурі 25оС у темряві. Зразки
для аналізу відбирали шприцом.
2.4. Методи хімічного аналізу
Визначення заліза. Концентрація загального і розчинного Fe(ІІ) визначали
фенантроліновим методом [31]. Визначення
розчинного Fe(ІІ) проводили у суспензії після її розведення 0,1 N HCl,
фільтрації через мембрану з порами 0,2 мкм та обробки 1N HCl (1 о
- Київ+380960830922