Ви є тут

Шапероноподібні властивості компонентів апарату трансляцї вищих еукаріотів

Автор: 
Лукаш Тетяна Олександрівна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2006
Артикул:
0406U004111
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали
У роботі було використано наступні реактиви та матеріали: набір 20 амінокислот,
N,N-метиленбісакриламід, акриламід, ЕДТА, імідазол, БСА виробництва фірми
“Sigma” (США); сефадекс G-200, креатинфосфат, креатинфосфокіназа, натрію
дезоксихолат, SDS, HЕPES виробництва фірми “Calbiochem” США); DTT, пуроміцин
виробництва фірми “Boehringer Mannheim” (Німеччина); спермін виробництва фірми
“Fluka” (Швейцарія); 2- меркаптоетанол, трис, MgCl2, гліцерин, ПЕГ 6000, NH4Cl
виробництва фірми “Merck” (Німеччина); TEMEД, PMSF “Serva” (Німеччина);
фосфоцелюлоза P11, ДЕАЕ- целюлоза DE-52, фільтри GF/C виробництва фірми
“Whatman” (Велика Британія); амонію персульфат, бромфеноловий синій, Кумасі
R-250 и G-250, гідроксиапатит Bio Gel НТР виробництва фірми “Bio-Rad” (США);
гепарин-сефароза, SP-сефароза, сефакрил S-400 виробництва фірми “Pharmacia”
(Швеція); нітроцелюлозні фільтри з діаметром пор 0,45 мкм виробництва фірми
“Sartorius-GmbH” (Німеччина); сцинтиляційна рідина OptiPhase “HiSafe”
виробництва фірми “SED” (Велика Британія).
Решту реактивів було маркіровано як “хч” і “осч”. Для приготування розчинів
використовували деіонізовану воду.
В процесі роботи використовували такі ізотопи: [14С]фенілаланін (50 Кі/моль,
100 мкКі/мл), [3H]GTP (9 Кі/ммоль, 1 мКі/мл), [3H]GDP (11,9 Кі/ммоль, 1 мКі/мл)
від “Amersham” (Велика Британія); [14С]серин, [14С]лейцин, [14С]ізолейцин (50
Кі/моль, 100 мкКі/мл) від “UVVVR” (Чехія).
Для роботи використовували наступне обладнання: центрифуги K-23, K-24, K-70
(Німеччина); J-21C, “Spinco” L-50, “Spinco” L-5, виробництва фірми “Beckman”
(США); спектрофотометр Specord UV-VIS (Німеччина); спектрополяриметр Jasco-700
(Японія); лічильник радіоактивності RackBeta 1219; хроматографічне обладнання
(колектор фракцій, самописець, детектор оптичної густини Uvicord, скляні
колонки) виробництва фірми „LKB” (Швеція).
Гель-електорофорез білків в денатуруючих умовах проводили за методом Лемлі
[143].
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Одержання 40S і 60S субчастинок рибосом та реасоційованих 80S рибосом з
печінки кроля.
Розчини:
буфер 1 (для гомогенізації): 20 мМ трис-HСl (рН 7,6), 0,2 М сахароза, 100 мМ
NH4Cl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ DTT;
буфер 2: 10 мМ трис-HСl (рН 7,6), 0,35 М сахароза, 20 мМ NH4Cl, 10 мМ MgCl2, 2
мМ DTT;
буфер 3: 50 мМ трис-HСl (рН 7,6), 6 мМ 2- меркаптоетанол, 10 % гліцерин;
буфер 4: 10 мМ трис-HСl (рН 7,6), 0,3 М сахароза, 2 мМ DTT;
буфер 5: 10 мМ трис-HСl (рН 7,6), 50 мМ КCl, 5 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 10 %
гліцерин;
буфер 6: 20 мМ трис-HСl (рН 7,6), 100 мМ NH4Cl, 3,5 мМ MgCl2, 6 мМ 2-
меркаптоетанол;
буфер 7: 20 мМ трис-HСl (рН 7,6), 0,35 M КCl, 3 мМ MgCl2, 6 мМ 2-
меркаптоетанол;
буфер 8: 20 мМ трис-HСl (рН 7,6), 100 мМ NH4Cl, 5 мМ MgCl2, 6 мМ 2b-
меркаптоетанол;
буфер 9: 20 мМ HEPES (pH 7,5), 100 мМ NH4Cl, 5 мМ MgCl2, 6 мМ 2-
меркаптоетанол.
Всі процедури виконували при 4 єC.
В основу методики покладено схему [135] з деякими модифікаціями [136, 137].
Дана методика передбачає одержання полісом, як джерела активно транслюючих
рибосом, звільнення їх від мРНК, дисоціацію на субчастинки та очистку від інших
компонентів апарату трансляції центрифугуванням у градієнті концентрацій
сахарози.
Одержання сумарних полірибосом. Печінку двох кролів гомогенізували в двох
об’ємах буферного розчину 1 в гомогенізаторі тканин РТ-1 3 хв при 8000 об/хв.
Гомогенат центрифугували 30 хв при 11000 об/хв (“Beckman” J-21C, ротор JA-14).
До одержаного постмітохондріального супернатанту додавали 10 % дезоксихолат
натрію до кінцевої концентрації 1 % і інкубували 1 годину на льоду при
постійному перемішуванні. Після інкубації розчин нашаровували на ступінчастий
градієнт сахарози (1 М – 1,8 М) в буфері 1 (по 8 мл кожного розчину) і
центрифугували 18 годин при 26000 об/хв (“Spinco” L-5, ротор Ti 50,2).
Одержаний осад полісом промивали кілька разів буфером 1 і в тому ж розчині
ресуспендували. Кількість одержаних полісом визначали спектрофотометрично,
враховуючи, що розчину рибосом із концентрацією 1 мг/мл відповідає А260 12 опт.
од. [136]. Розчин полісом зберігали в рідкому азоті.
Із двох кролів в середньому одержували 1 тис. од. А260.
Одержання сумарних ARS і рН 5-фракції (ARS і білкових факторів трансляції).
Препарати сумарних ARS із печінки кроля одержували за модифікованим методом
Келлер і Замечника [138]. Печінку гомогенізували в трьох об’ємах буфера 2 в
гомогенізаторі тканин РТ-1 3 хв при 8000 об/хв. Гомогенат центрифугували 30 хв
при 11000 об/хв (“Beckman” J-21C, ротор JA-14). Пострибосомний супернатант
розводили в 2 – 3 рази буфером 2 і наносили на колонку з ДЕАЕ-целюлозою.
Колонку промивали буфером 3. Білок елюювали буфером 3, що містив 0,25 М КCl.
Концентрацію білка визначали за методом Бредфорд [139], використовуючи БСА в
якості стандарту.
Для одержання рН 5- фракції печінку кроля гомогенізували в трьох об’ємах
буферного розчину 4. Обривки тканин видаляли центрифугуванням при 6000 об/хв 5
хв (К-27). Одержаний супернатант центрифугували 2 години при 24000 об/хв
(“Spinco” L-5, ротор SW 25). Верхні 2/3 постмікросомального супернатанту
відбирали і розводили двома об’ємами води з 3 мМ MgCl2 і 2 мМ DTT, після чого,
при постійному перемішуванні, додавали 1 М оцтову кислоту до рН 5,1 і
інкубували 10 хв на льоду. Осад збирали центрифугуванням при 5000 об/хв 10 хв
(К-23) і розчиняли у невеликій кількості буфера 5. Розчин центрифугували при
2000 об/хв 20 хв (К-23), осад ресуспендували і знову центрифугували. Надосадові
рідини об’єднували і заморожували в рідкому азоті.
Розділення і очистка субчастинок рибос