Розділ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Характеристика реактивів
Для приготування розчинів та живильних середовищ використовували мінеральні
солі та цукри «осч» (Хімлаборреактив, Україна). В роботі застосовували
антибіотики: канаміцин (Курганський комбінат «Синтез», Росія), цефотаксим
(Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод, Україна), тетрациклін (Sigma, США),
карбініцилін (Duchefa, Нідерланди), ріфампіцин (Мосмедпрепараты, Росія). В
роботі також використовували реактиви:
Агар Хімлаборреактив, Україна
Агароза Sigma, США
БАП Duchefa, Нідерланди
бромістий етидій Sigma, США
ГК3 Sigma, США
2,4 – Д Serva, США
Дезоксинуклеотидтрифосфати Phormaceae, Швеція
ЕДТА Sigma, США
ІМК Duchefa, Нідерланди
ІОК Duchefa, Нідерланди
МЕС Duchefa, Нідерланди
НОК Duchefa, Нідерланди
PPT Duchefa, Нідерланди
Tris-ОН Sigma, США
Taq-полімераза Promega
Triton X-100 Sigma, США
X-Gluc Duchefa, Нідерланди
2.2. Векторні конструкції та бактеріальні штами
Для генетичної трансформації використовували бінарні вектори: pCB001, pCB002,
pICH7878, pICBV5, pCB004, pICBV19, pIC411 та pICH3744. Генетичні конструкції
pICH7878, pICBV5, pICBV19, pIC411 та pICH3744 були люб’язно надані компанією
Icon Genetics GmbH (м. Халле, ФРН).
Т-ДНК плазміда pCB001 [310] містить селективний маркерний ген
неоміцинфосфотрансферази II (nptII), транскрипція якого контролюється
промотором і термінатором гена нопалінсинтетази nos A. tumefaciens, та
репортерний ген b-глюкуронідази E. coli, який знаходиться під контролем 35S
промотору вірусу мозаїки цвітної капусти і має термінатор гена нопалінсинтетази
nos (рис. 2.1). Для бактеріальної селекції плазміди pCB001 містить маркер
стійкості до канаміцину.
Рис. 2.1. Схематичне зображення Т-ДНК бінарного вектору pCB001.
Т-ДНК бінарного вектору pCB002 містить селективний маркерний ген
неоміцинфосфотрансферази II, що регулюється промотором і термінатором гена
нопалінсинтетази nos, і ген b-глюкуронідази, який знаходиться під контролем
промотору та термінатору 35S вірусу мозаїки цвітної капусти. Структурна частина
gusA гену містить інтрон PIV2 гену ST-LS1 [311] (рис. 2.2). pCB002 також
містить бактеріальний селективний маркер – ген стійкості до канаміцину.
Рис. 2.2. Схематичне зображення Т-ДНК бінарного вектору pCB002.
- інтрон.
Т-ДНК плазміди pICH7878 містить ген неоміцинфосфотрансферази ІІ (NPTII), який
знаходиться під контролем промотору та термінатору гена nos (рис. 2.3).
Плазміда рCН7878 містить також бактеріальний селективний маркер – ген стійкості
до карбеніциліну.
Рис. 2.3. Схематичне зображення Т-ДНК бінарного вектору pICH7878.
Т-ДНК плазміди pICBV5 містить ген гігроміцинфосфотрансферази (HPT), експресія
якого регулюється 35S промотором з вірусу мозаїки цвітної капусти та
термінатором гена нопалінсинтетази (рис. 2.4). Бінарний вектор pICBV5 також
містить бактеріальний селективний маркер – ген стійкості до карбеніциліну.
Рис. 2.4. Схематичне зображення Т-ДНК бінарного вектору pICBV5.
Т-ДНК бінарного вектору pCB004 містить селективний маркерний ген
неоміцинфосфотрансферази II, що регулюється промотором і термінатором гена
нопалінсинтетази nos, і ген ацетолактатсинтетази (als) з арабідопсису з
мутацією в 653 положенні (Ser653Asn), експресія якого контролюється власними
промотором та термінотором (рис. 2.5). Для бактеріальної селекції вектор pCB004
містить ген стійкості до канаміцину.
Рис. 2.5. Схематичне зображення Т-ДНК бінарного вектору pCB004.
Плазміда pICBV19 містить гени b-глюкуронідази (GUS) та
фосфінотрицинацетилтрансферази (PAT). Структурна частина гену gusA знаходиться
під контролем 35S промотору вірусу мозаїки цвітної капусти та термінатору гена
нопалінсинтетази, ген bar – під контролем промотору гену нопалінсинтитази та
термінатору гена октопіінсинтетази ocs A. tumefaciens (рис. 2.6). Між 35S
промотором та структурною частиною gusA знаходиться W - 5'-послідовність, що
нетранслюється, вірусу мозаїки тютюну. Для бактеріальної селекції вектор
рICBV19 містить маркер – ген стійкості до карбеніциліну.
Рис. 2.6. Схематичне зображення Т-ДНК бінарного вектору pICBV19.
Плазміда pIC411 містить гени неоміцинфосфотрансферази ІІ (NPTII), транспозази
(SpmTPase) та b-глюкуронідази (GUS). Структурна частина гену nptII знаходиться
під контролем промотору гена нопалінсинтитази та термінатору гена
октопінсинтетази, гени SpmTPase та gusA - під контролем 35S промотору вірусу
мозаїки цвітної капусти. Між промоторною та структурною частинами гену gusA
знаходиться химерний неавтономний dSpm елемент, який містить ген bar між своїми
термінальними кінцями. Бінарний вектор pIC411 також містить бактеріальний
селективний маркер – ген стійкості до тетрацикліну (рис. 2.7).
Рис. 2.7. Схематичне зображення Т-ДНК бінарного вектору pIC411.
Плазміда pICH3744 біля правого повтору RB, який обмежує Т-ДНК, містить сайт
рекомбінації loxА, який межує з bar геном без промотору. Т-ДНК вектору також
містить селективний ген неоміцинфосфотрансферази ІІ та додаткові сайти
рекомбінації loxМ та loxА Cre/lox системи рекомбінації бактеріофага P1. Для
бактеріальної селекції бінарний вектор pІCB3744 містить маркер стійкості до
карбеніциліну (рис. 2.8).
Рис. 2.8. Схематичне зображення Т-ДНК бінарного вектору pICH3744.
Генетичну трансформацію рослин проводили за допомогою агробактерій:
нопалінового штаму A. tumefaciens GV3101;
октопінового штаму A. tumefaciens pGV2260;
агропінового штаму A. rhizogenes A4.
Плазмідна ДНК бінарних векторів, застосованих в роботі, була перенесена до
агробактеріальних штамів за методом, запропонованим в роботі [312
- Київ+380960830922