ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Лабораторные животные и моделирование эксперимента
Экспериментальные исследования проведены на 230 половозрелых самцах крыс линии
Вистар в возрасте 4, 12 и 18 месяцев. Все животные содержались в стандартных
условиях [68] экспериментально-биологической клиники Одесского государственного
медицинского университета.
В соответствии с целью и задачами исследования все экспериментальные животные
были разделены на следующие группы:
интактные животные в возрасте 4, 12 и 18 месяцев (30 крыс);
животные, облученные в суммарной дозе 0,5 Гр (40 крыс, возраст 4 месяца);
животные, у которых моделировали аминотриазоловую катаракту (40 крыс, возраст 4
месяца);
животные, у которых моделировали аминотриазоловую катаракту на фоне g-облучения
в суммарной дозе 0,5 Гр (40 крыс, возраст 4 месяца);
животные, у которых моделировали аминотриазоловую катаракту на фоне g-облучения
в суммарной дозе 0,5 Гр и проводили лечение "Квинаксом" (40 крыс, возраст 4
месяца);
животные, у которых моделировали аминотриазоловую катаракту на фоне g-облучения
в суммарной дозе 0,5 Гр и проводили лечение "Квинаксом" и "Карсилом" (40 крыс,
возраст 4 месяца).
Экспериментальные животные второй группы подвергались общему g-облучению на
гаматерапевтической установке АГАТ-Р № 83 (изотоп 60Со). Облучение проводили
натощак, в девять часов утра, при следующих технических условиях: мощность дозы
142 рад/мин, расстояние от источника до поля 0,75 м; размеры поля 0,2 ґ 0,2 м;
по 0,05 Гр за один сеанс (экспозиция две секунды) каждые 72 часа до достижения
суммарной дозы 0,5 Гр. Во время облучения животные находились в специально
изготовленных клетках-фиксаторах из органического стекла. Дозиметрический
контроль проводился дозиметрической службой Областного онкологического
диспансера (г. Одесса), на базе которого проводили облучение.
Аминотриазоловую катаракту у крыс третьей группы моделировали пероральным
введением 0,2% раствора аминотриазола, из расчета 50 мл на 1 кг массы тела
животного в сутки [155], в течение 28 дней. Аминотриазоловую катаракту на фоне
г-облучения моделировали введением 0,2% раствора аминотриазола, из расчета 50
мл на 1 кг массы тела животного в сутки, параллельно облучая животных в
суммарной дозе 0,5 Гр в течение 28 дней [109].
Животным соответствующих экспериментальных групп закапывали "Квинакс" по одной
капле три раза в день в течение 28 дней. "Карсил" вводили через полиэтиленовый
зонд в желудок, из расчета 20 мг/ кг массы тела в сутки, ежедневно, в течение
28 дней. Расчет дозы "Карсила" для энтерального введения экспериментальным
животным производили в соответствии с существующими рекомендациями [36].
Оценку состояния хрусталиков во всех группах проводили биомикроскопически с
помощью насадки монокулярной щелевой лампы на электроофтальмоскоп на 7-е, 14-е,
21-е и 28-е сутки эксперимента. В те же сроки часть животных выводили из
эксперимента, для изучения тиол-дисульфидной системы сыворотки крови и
хрусталиков.
Экспериментальные исследования проведены в соответствии с научно-практическими
рекомендациями по содержанию лабораторных животных, и работы с ними [95] и
положений «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые
используются для экспериментальных и научных целей».
2.2 Методы экспериментальных исследований
Крыс выводили из эксперимента быстрой декапитацией [4]. Выполняли энуклеацию,
проводили извлечение хрусталика и готовили из него навеску на торзионных весах.
Ткани хрусталика гомогенизировали в системе стекло – тефлон, с помощью
микроразмельчителя тканей РТ-2, в течение одной минуты при 5000 оборотах в
минуту. Среда выделения: ТРИС-буфер, рН 9,5 в соотношении 1 г тканей хрусталика
- 10 мл буферного раствора. Полученный гомогенат центрифугировали 15 минут при
3000 оборотах в минуту для получения супернатанта.
Кровь у крыс забирали после декапитации. Получали сыворотку крови по
стандартной методике [31]. В супернатанте и сыворотке крови определяли
количество Аg+-чувствительных сульфгидрильных и дисульфидных групп белкового
происхождения и сульфгидрильных групп небелкового происхождения, методом
обратного амперометрического титрования [31, 107, 136], с помощью прибора для
амперометрического титрования (производство "Химлаборприбор" ТУ 25-11-364-69,
СССР).
Принцип метода заключается в следующем. В кювету для титрования добавляют
трис-буфер (трис-гидроксиметил-аминометан) и раствор AgNO3. Вследствие этого, в
электрической схеме установки, которая состоит из погруженных в кювету для
титрования индикаторного платинового электрода и каломельного электрода
сравнения, возникает диффузный ток, как результат восстановления ионов серебра
на платиновом индикаторном электроде. Величину тока контролируют с помощью
микроамперметра. Прирост тока происходит пропорционально прибавленному раствору
AgNO3. Потом в кювету для титрования вносят биоматериал. Ионы серебра
связываются сульфгидрильными группами с образованием стойкого меркаптида, в
результате чего происходит пропорциональное снижение величины исходного
диффузного тока. Количество Ag+-чувствительных сульфгидрильных групп в
биоматериале, эквивалентное количеству связанных ионов серебра, рассчитывали по
формулам [31, 136].
Определение содержания дисульфидных групп проводили методом обратного
амперометрического титрования [136, 139]. Принцип метода заключается в
следующем. Титрование проводится аналогично вышеупомянутому способу, но в
присутствии избытка ионов серебра. После определения количества
Ag+-чувствительных сульфгидрильных групп в биоматериале, в кювету для
титрования вносят сульфит натрия (Na2SО3), кото
- Київ+380960830922